圆叶葡萄抗性种质及利用

杨博涵，傅佩宁，卢江*

（上海交通大学农业与生物学院葡萄与葡萄酒研究中心，上海 200240）

圆叶葡萄 [Muscadinia rotundifolia（Michx.）Small]起源于美国[1-3]，主要分布在特拉华州到佛罗里达州中部，以及从墨西哥湾到德克萨斯州东部地区[4-5]。与葡萄属相比，圆叶葡萄在染色体数量、抗性、果实特征、栽培方法以及树体形态等方面都存在很大差异。其中，最显著的差异是对主要病虫害具有极强的抗性，尤其是对葡萄第一大病害霜霉病免疫。

世界范围内有多种葡萄病虫害，而主栽葡萄品种抗性差是制约葡萄产业健康快速发展的关键[6]。早在19世纪，葡萄根瘤蚜就曾经对欧洲的葡萄产业造成毁灭性打击。而在中国，湿润多雨的南方产区以及部分采收前多雨的北方产区，葡萄霜霉病会严重危害葡萄果实的叶片与果实，造成大量减产[7]。而随着大棚栽培的推广，许多产区又受到葡萄白粉病的侵害[8]。而为了抑制这些病害，就需要大量施用化学农药，这不仅会对土壤和地下水造成长久的污染，同时也导致了病原菌耐药性的增强，最终导致农药的过量喷施或者失效[9]。利用葡萄中已有的抗性种质，培育抗病虫害的葡萄品种，可以从根源上减少病虫害的发生。圆叶葡萄对根瘤蚜、剑形线虫等多种虫害，均对霜霉病、白粉病、黑痘病、皮尔斯病等多种病害具有高度抗性甚至完全免疫[10]。除了病虫害等生物胁迫，圆叶葡萄具有较厚的果皮，果实内含有多种酚类物质，因此对于高温高湿、紫外辐射等逆境也具有优良抗性[11]。这些特质表明了圆叶葡萄是不可多得的抗性种质来源，不仅可以在原本不适宜种植的地区进行推广，创造经济价值，还暗示着圆叶葡萄品种中蕴含着许多抗病基因可以挖掘和利用。本文将从圆叶葡萄抗性出发，对其抗性种质挖掘、研究方法以及利用推广等方面进行综述，以期为圆叶葡萄抗性资源的挖掘利用提供一定的参考。

表1 圆叶葡萄与真葡萄的病虫害抗性对比Table 1 Comparison of disease and pest resistance between Muscadine and Vitis

1 圆叶葡萄抗病种质挖掘

1.1 抗霜霉病

葡萄霜霉病（Downy mildew）起源于美国东北部，由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.) Berl et de Toni]引起。在19世纪时，欧洲为了抵御根瘤蚜的泛滥，从美国引进了大量抗根瘤蚜的葡萄品种作为砧木，而葡萄霜霉菌也借此传向欧洲并广泛传播。截止目前，世界各地的葡萄产区均有葡萄霜霉菌的报道，是公认的第一大病害。圆叶葡萄对霜霉病免疫，但是其免疫机制尚不明确。

2003年，Merdinoglu等人将圆叶葡萄与几个欧亚种葡萄杂交，并在回交两代后获得了具有圆叶葡萄背景的139株BC2回交群体群体，使用RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）以及SSR（Simple Sequence Repeat）标记，利用区间作图法在12号染色体10 Mbp处定位到了第一个抗葡萄霜霉病的数量性状位点（Quantitative Trait Locus，QTL）。该位点解释了73%的观测变异率和83%的遗传变异率，并将其命名为Rpv1[12]；之后Feechan等人又将其精确定位并挖掘到主效基因，将其命名为MrRPV1[13]。随后的2006年，Wiedemann-Merdinoglu等人利用具有圆叶葡萄背景的株系‘8624’作为父本，欧亚种葡萄‘赤霞珠’作为母本，在18号染色体上定位到另一个抗霜霉病位点Rpv2[14]。

近年来，随着研究的深入，圆叶葡萄抗病的作用机制也在逐渐被了解。2012年，Yu等人的研究发现，圆叶葡萄在受到霜霉菌侵染时会形成胼胝质沉淀，并且在感染初期就抑制游动孢子的萌发，从而起到阻碍霜霉菌侵染繁殖的目的[15]。王超霞对抗病圆叶葡萄品种‘Noble’的研究表明，白藜芦醇及其衍生物的积累模式、相关基因的表达模式受到霜霉菌侵染的诱导，并在葡萄抗病过程中发挥广谱的抗性作用[16]。

1.2 抗白粉病

葡萄白粉病（Powdery mildew）由葡萄钩丝壳菌[Uncinula necator(Schw.) Burr.] 引起，主要侵害叶片、新梢和果实等幼嫩部位。感染时，受侵染的部位覆盖白色粉状物，严重时可导致侵染部位萎缩、枯萎。葡萄白粉菌在干燥、温暖的条件下可以迅速传播，难以彻底根除。

研究人员陆续从圆叶葡萄品种及其杂交后代上定位到诸多与抗葡萄白粉病相关的QTLs，如从具有圆叶葡萄背景的单株VRH3082-1-42的12号染色体上定位到Run1[13,17]，从Magnolia和Trayshed的18号染色体上定位到Run2[18]，以及Regale的14号染色体上定位到Ren5位点[19]。有趣的是，Rpv1和Run1被定位到同一个位点[12-13,20]。Rubio对于抗虫QTL的定位研究中也发现，有些抗剑形线虫QTL位点附近也包含其他抗病QTL，例如Rpv3紧密连锁的一个标记与XiR4紧密连锁[21]。这表明，在进化的过程中，与抗性相关的基因可能会有成簇聚集、共同进化的现象出现。

1.3 抗黑痘病

葡萄黑痘病（Spot anthracnose）由葡萄痂囊腔菌[Sinoe ampelina(de Bary) Shear] 引起，多发于4—6月雨水较多的季节。这种病菌可以侵染葡萄的果实、叶片、卷须和叶柄，症状通常表现为许多圆形斑点，这些斑点扩大后变成凹陷并产生圆形边缘的病变，具有非常大的破坏性。

此前人们认为，所有的圆叶葡萄都对葡萄黑痘病具有抗性，而Louime等人证实圆叶葡萄黑痘病抗性具有多态性，对51个圆叶葡萄品种接种黑痘病致病菌并评估其抗病性，其中，‘Noble’‘Fry’‘Regale’等12个品种对黑痘病具有极强抗性。深入研究发现，查尔酮合酶、二苯乙烯合酶等关键酶合成基因只在抗性品种中表达，这表明这些基因可能是圆叶葡萄抗黑痘病的主效功能基因[22]。

1.4 抗皮尔斯病

葡萄皮尔斯病（Pierce's disease）是葡萄主要的细菌病害，其致病菌为革兰氏阴性细菌Xylella fastidiosa。葡萄感染皮尔斯病后，叶片从边缘处出现不规则形状的干枯病斑，且病斑呈现有层次的波纹状，引起葡萄叶片大面积干枯，严重影响正常的光合作用，导致植株生长衰弱，通常只能存活几年，危害葡萄产业的健康发展[23-24]。目前，该病害在美洲地区较为严重。

我国目前种植的鲜食和酿酒葡萄主要为欧亚种，普遍易感皮尔斯病，而1968年就已经有研究证实圆叶葡萄对皮尔斯病具有抗性[25]。Krivanek和Walker利用酶联免疫法（ELISA）检测接种在不同葡萄品种上Xylella fastidiosa的数量，证实圆叶葡萄具有皮尔斯病抗性[26]。Ruel等人通过对多个栽培种和野生种的抗性水平进行定量接菌评价，进一步证实，与欧亚种和美洲种等葡萄相比，圆叶葡萄对皮尔斯病抗性更强[27]。且圆叶葡萄对皮尔斯病的抗性已经被人们加以利用，作为育种亲本培育具有抗性的品种[28]。

1.5 其他病害

圆叶葡萄除对上述病害具有极强的抗性之外，对于根腐病、环带状叶斑病、顶枯病等多种病害高抗或免疫，但这些病害的相关抗性机理还有待进一步研究[10-11]。

2 圆叶葡萄抗虫种质挖掘

2.1 抗根瘤蚜

19世纪，葡萄根瘤蚜（Phylloxera,Daktulosphaira vitifoliae）的泛滥对欧洲葡萄产业造成了毁灭性的打击。法国在1868—1877年约有29万 hm2的葡萄园被根瘤蚜摧毁[29-30]。近期，中国多地也发现了葡萄根瘤蚜的踪迹[31]。可以说，根瘤蚜一直以来都是葡萄产业的极大威胁，且从未被根治。

圆叶葡萄对根瘤蚜具有极强抗性，也一直被作为抗虫亲本进行育种[32]。Rubio等人利用具有圆叶葡萄背景，且对病虫害具有抗性的单株VRH8771进行定位，在7号染色体上挖掘到了一个主效抗根瘤蚜位点RDV6。该位点可解释70%以上的表型变异率，同时在3号和10号染色体上分别定位到抗根瘤蚜位点RDV7和RDV8。这些位点的发掘为圆叶葡萄抗根瘤蚜种质的利用奠定了非常好的基础[21]。

2.2 抗剑形线虫

葡萄剑形线虫（Dagger nematode,Xiphinema index）是葡萄上一种常见的虫害，并且是葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus,GFLV）等的传播媒介，而该病毒是葡萄扇叶病的病原体[33]。受剑形线虫侵染的植株生长衰弱，新梢短，严重时完全丧失结果能力。目前最为常见的是美洲剑形线虫和标准剑形线虫，而湖南剑形线虫于1992年在我国被发现，但相关研究还比较少[34]。

Rubio等在具有圆叶葡萄背景的剑形线虫抗性单株VRH8771的9号、10号和18号染色体上各定位到一个抗剑形线虫的位点，分别命名为XiR2、XiR3和XiR4[21]。这从遗传层面表明圆叶葡萄具有抗剑形线虫的基因。

2.3 抗根结线虫

葡萄根结线虫（Root-knot nematode）是葡萄上另一种常见的虫害，在中国危害最为严重的是南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。根结线虫以幼虫侵入葡萄幼嫩的根尖端组织，在吸收根或生长根上形成根结，侵染严重时根系几乎无吸收根。在地上部，受害植株叶片产生圆形病斑，并且随时间由黄色变为灰白色，外圈有紫褐色晕圈并穿孔，严重时造成叶片枯萎掉落，葡萄植株生长缓慢且衰弱，产量低。

圆叶葡萄对于包括根结线虫在内的多种病虫害均有优异的抗性甚至完全免疫。2008年Riza等人的文章中就提及圆叶葡萄是抗根结线虫的重要种质来源[35]，而2015年Li等人的研究证实，圆叶葡萄叶片提取物能有效杀死根结线虫。这从产物层面揭示了圆叶葡萄或许是通过生成具有杀虫功能的代谢物来实现抗根结线虫的作用[36]。

3 圆叶葡萄抗性种质利用

由于圆叶葡萄具有丰富的抗性种质资源，因此利用圆叶葡萄优质种质培育高产、优质、抗病的葡萄新品种一直是育种家的目标。育种家们已经利用杂交育种的方式，筛选并培育出许多新的圆叶葡萄品种。而欧亚种葡萄由于出色的酿酒与鲜食品质被人们广泛接受，但却饱受病虫害的危害，因此如何利用圆叶葡萄的抗性种质改良已有的欧亚种葡萄品种也成为了现代重要的育种手段。

3.1 圆叶葡萄抗性育种技术进展

随着分子技术的发展，多种分子标记技术被用于构建遗传图谱、定位抗性相关QTL及相关基因。1995年Lodhi等人利用RAPD和RFLP标记，第一次构建了葡萄杂交群体的遗传图谱[37]。2008年Summaira等人首次利用简单重复序列标记（SSR）对57份葡萄材料（其中39份圆叶葡萄）进行了鉴定，最终发现圆叶葡萄品种中出现了88个独特的等位基因，这些基因没有在此前包含600多个欧亚种葡萄品种的数据库中出现过[35]。这也意味着圆叶葡萄和欧亚种葡萄巨大的性状差异与其基因差异密切相关。此后，圆叶葡萄抗性基因及其机制也随着更多的研究逐渐被揭晓。

现代分子遗传学已经形成了一套通过“构建杂交群体-绘制遗传图谱-关联表型鉴定-QTL定位-图位克隆”的方法，用来定位可能含有目的基因的染色体位点，挖掘主效基因[38]。在不同的研究过程中，虽然研究方法不尽相同，但是其基本原理相似。首先选择具有表型差异的葡萄品种作为亲本并构建性状分离的杂交/回交群体，随后提取DNA并构建其遗传图谱；根据遗传图谱以及表型进行连锁分析，确定出与表型紧密连锁的分子标记；此后通过不断的杂交/回交，增加交换事件频率或增大标记密度等方法，逐渐缩短定位到的QTL区段。当包含有抗性位点的区段足够小时，可以通过构建YAC（Yeast Artificial Chromosome）文库或者BAC（Bacterial Artificial Chromosome）文库的方式，筛选出所要的主效基因。

尽管利用圆叶葡萄与欧亚种进行杂交的研究已超过一个世纪，然而圆叶葡萄含有20对染色体，真葡萄含有19对染色体，染色体数目的差异导致了减数分裂时基因组之间的不完全同源性[39]，因此圆叶葡萄与真葡萄杂交后结实率低，这导致了难以构建足够数量的子代群体用以进行遗传分析。而得到的少量杂交种子也多为39条染色体的不育子代，使得杂交工作难以继续推进。然而研究人员也有成功得到圆叶葡萄与真葡萄可育杂交后代的例子，1986年法国研究人员在进行白粉病抗性育种时，培育出了‘NC6-15’等可育的圆叶葡萄与真葡萄的杂交后代[20,35,40]。这项工作为此后利用杂交手段挖掘抗性种质奠定了基础。

组织培养技术也被应用于圆叶葡萄及抗性育种中，为了克服葡萄远缘杂交不亲和这一难题，研究人员利用原生质体融合以及胚挽救技术以获得圆叶葡萄与真葡萄杂交后代。前人已有报道圆叶葡萄原生质体的分离以及培养条件[41]，并且已有用胚挽救技术获得欧亚种葡萄与圆叶葡萄杂种抗病无核F1代的实例[42]。然而近些年进行的抗性QTL定位工作多数都利用欧亚种葡萄、河岸葡萄（V.riparia）、沙地葡萄（V.rupestris）、美洲葡萄（V.labrusca）及其种间杂种进行研究，而在圆叶葡萄上进行的研究逐渐变少[43]。

3.2 圆叶葡萄抗性种质利用

由于圆叶葡萄具有多种优异的抗性，因此培育品质优异的圆叶葡萄，推广种植圆叶葡萄品种就是最直接的抗性资源利用方式[44]。而且圆叶葡萄本身香气浓郁，还具有很多生物活性物质如多种糖类、花色苷、白藜芦醇等，这些物质对人体健康十分有益[45-47]，这些优良特性使得圆叶葡萄推广具有可行性。在上世纪70年代，‘Carlos’和‘Noble’被育出，这两个品种都具有较好的抗病性。同时由于其具有两性花和较强的适应性，其果实产量也较高（15～25 t/hm2），直到现在，这两个品种都是全世界种植范围最广的用于酿酒的圆叶葡萄品种。而且近些年来新发布的品种已经能够将两性花与较大的果实结合起来，以适应人们对于鲜食葡萄的需求，有些鲜食圆叶葡萄品种单个果实甚至能够达到15 g[48]。而单雌花的品种由于产量较低且不规则，逐渐被淘汰[49]。

圆叶葡萄进入中国的时间较晚。我国南方地区气候湿润多雨，传统的欧亚种鲜食、酿酒葡萄在此环境下容易爆发严重的病虫害。而圆叶葡萄对病虫害抗性高，适应性强，且加工品质优良，能够弥补传统主栽品种在南方地区表现出的不足。卢江等人于2006年将圆叶葡萄引入中国，当前已有优良的圆叶葡萄品种20余个，其中包括鲜食品种、酿酒（制汁）专用品种，以及酿酒鲜食兼用品种。在推广方面，已有多个品种推广定植于广西、云南、浙江及福建等地[50-51]，而其中有5个品种（Noble、Carlos、Fry、Alachua、Granny Val）在广西、浙江等地区可以实现一年两熟[52-54]。随着圆叶葡萄在中国的试种成熟以及推广，对于不同圆叶葡萄品种的栽培管理技术的研究也正在开展[55]，相关的圆叶葡萄产品也正在逐步开发与完善。基于圆叶葡萄优异的病虫害抗性，葡萄抗性QTL以及主效抗性基因的挖掘工作也在陆续开展。

4 展望

圆叶葡萄由于其具有的特殊品质、遗传特征，成为了葡萄这一大类作物中最为特殊的存在。人类已经开发、利用圆叶葡萄数百年，起初将其作为装饰材料或者抗性砧木使用，而随着育种技术以及分子技术的发展，圆叶葡萄具有的优异抗性也逐渐被人们揭晓并利用，当前已成为具备鲜食、酿酒、制干、制汁、制酱以及抗性育种等价值的重要经济作物。

未来应加大对圆叶葡萄抗性种质的利用，逐步挖掘圆叶葡萄具有的多种抗性基因，并通过分子生物学、分子遗传学等手段将其导入现有的优秀欧亚种栽培品种中，改良已有的葡萄品种或培育具有多种抗性的欧亚种葡萄。这样能最大程度的保留现有欧亚种葡萄的风味特征，同时提高葡萄抗病性，减少化肥、农药的使用，减少污染并提升现有葡萄产业的经济效益。

当前圆叶葡萄的抗性育种还有许多难点有待解决。（1）虽然像霜霉病、白粉病等病害的抗性位点已经得到了较为充分的研究，但是还有许多圆叶葡萄抵抗其他病害的抗性位点缺少研究，有待挖掘；（2）尽管人们一直认为借助抗性基因实现病虫害抗性比依赖农药控制病虫害更稳定，但是已经出现了抗性位点对霜霉菌抗性失效的研究实例[56]，因此在进行抗性育种时也需要尽可能的进行多种质聚合育种，使同一单株中具有多个抗性位点。这样才能够使得植株的抗性更持久；（3）虽然真葡萄属中许多葡萄品种已经被证实对许多病虫害表现出抗性，且已定位出抗性基因位点，但是如果能够利用亲缘关系更远的圆叶葡萄的丰富抗性资源，实现多种抗性聚合，则能够提前避免未来可能出现的病虫害传播，更好地实现对病虫害的防范；（4）当前利用抗性种质的技术手段主要为杂交育种，育种周期较长，而转基因技术可以通过将已发现的抗性基因直接转入到易感品种的基因组中，使得易感品种携带有新的抗性，更快更有效的利用抗性种质，缩短育种周期。

圆叶葡萄本身兼具高产、易栽培管理、易机械化、附加值高等特点，其果实富含的多种多酚类物质如白藜芦醇、鞣花酸等具有优秀的抗氧化、抗癌作用，对人体健康大有裨益，而且具有其他葡萄品种没有的特殊香气，因此改良和推广圆叶葡萄既能给农户带来丰厚的经济价值，又能满足人们对于健康饮食的追求，具有优良的前景。圆叶葡萄未来的发展也将围绕着改良现有葡萄品种以及培育新的圆叶葡萄品种这两方面来进行，这对研究人员、育种家等提出了新的挑战。