关于微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度评估

戴明男

（中纺检测（福建）有限公司，福建泉州 362000）

维生素B6又可称之为吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多个成分，可溶于水，参与人体多种代谢反应。维生素B6是米粉中重要营养组成之一，但因含量处于较低的水平，测定难度较大。《食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定》（GB 5009.154—2016）规定了食品中维生素B6的含量测定方法，微生物法为标准第二法，适用于不同类别食品中维生素B6的测定。本文评估了利用GB 5009.154—2016第二法测定米粉中维生素B6含量的不确定度。

1 材料与方法

1.1 材料

SHP-250型生化培养箱、Thermo酶标检测仪、多管式旋涡混合器、水浴锅、0.2 μm无菌滤膜[1]。市售婴幼儿配方米粉、维生素B6标准品（≥99.0%），柠檬酸盐缓冲液（pH为4.5）、马铃薯酸性磷酸酶、无菌水。

1.2 实验方法

1.2.1 操作步骤

在250 mL锥形瓶内，放入2.5 g米粉样品，利用单标线吸量管加入0.05 L柠檬酸盐缓冲液后、0.025 L马铃薯酸性磷酸酶，在多管式旋涡混合器内混合均匀。进而放置在无光照直射的37.0 ℃室温环境中，孵育60 min，间隔手动振荡[2]。孵育完毕后，加入0.1 L灭菌水逐级稀释，在95.0 ℃水浴锅内振荡，在短时间内冷却至室内温度后过滤、无菌离心取上清液[3]。进而依据GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的标准品溶液。取微孔板条，在30.0 ℃无光照直射条件下孵育。孵育后，在Thermo酶标检测仪中，选择630 nm波长，进行吸光度读取[4]。

1.2.2 测定计算

GB 5009.154—2016第二法规定米粉中维生素B6含量需要依据下式进行计算：

X=C×n×m×0.822 （1）

式（1）中：X为维生素B6含量，C为样品在标准曲线下读取的浓度，n为稀释倍数，m为样品量[5]。其中维生素B6含量的相对标准不确定度为：

式（2）中：Urel(X)为维生素B6含量的相对标准不确定度，Urel(C)为样品在标准曲线下读取的浓度的标准不确定度，Urel(n)为稀释倍数的标准不确定度，Urel(m)为样品量的标准不确定度。

2 结果与分析

2.1 样品称量引入的不确定度

用电子天平精准称量样品2.500 1 g，天平精确度为0.1 mg。由天平鉴定证书可知天平最大重复性误差为0.15 mg，在称取量大于0 g但小于50 g时，指示数值误差为0.1 mg。利用矩阵分布包含因子为的B类不确定性标定，得出标准不确定度为合成标准不确定式则样品称量时的相对不确定度为0.080 75/2.500 1≈0.032 30。

2.2 样品稀释定容引入的不确定度

上述操作用仪器均为玻璃材质，玻璃材质校准、温度干扰均对液体体积具有影响，进而引发维生素B6测定偏差。根据最大允许误差，依据包含因子k为的均匀分布处理方法进行不确定度分量计算，可得出5 mL单标线吸量管最大允许误差为±0.015，不确定度为0.008 66，相对不确定度为0.001 68；而250 mL单标线容量瓶最大允许误差为±0.15，不确定度为0.086 6，相对不确定度为0.000 339，合成剥离器具校准引入的不确定度分量为

考虑到微生物测定区域温度变化幅度在5.0 ℃左右，水膨胀系数为0.000 21 ℃，依据包含因子k为的矩形分布计算可知，因室温变化而引起的相对标准不确定度为合成温度变化引起的操作用仪器相对不确定度分量可得出结果为0.000 857 0，则样品稀释形容引入的不确定度就为

2.3 样品测量中引入的不确定度

样品测量不确定性主要源于测量重复性。对定值样品中的维生素B6含量进行平行测定，测定次数为8，得出结果分别结果如表1所示。根据贝塞尔公式，计算得出标准不确定度相对标准不确定度约等于0.000 363。则微生物法测定米粉中维生素B6的总不确定度为：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。

表1 样品重复性测定结果（n=8）

3 结论

微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度主要来源于样品称量、样品稀释定容、样品测量等几个环节，涉及了标准品纯度、天平自身精密度、移液器与容量瓶容差、样品测定重复性、试验环节温度变化等几个方面。测定人员应严格依据GB 5009.154—2016的要求，进行微生物法操作，为米粉安全监管提供充足支持。