离子抑制色谱法测定伊班膦酸钠原料药中的有关物质

陈霞，张洁，董瑞（成都市食品药品检验研究院，成都 610045）

伊班膦酸钠，化学名称为1-羟基-3-（N-甲基-戊胺基）-亚丙基二膦酸-钠盐-水合物，临床上用于治疗绝经后骨质疏松症、恶性肿瘤溶骨性骨转移以及伴有或不伴有骨转移的恶性肿瘤引起的高钙血症，目前的剂型为注射液[1-4]。该药物的最后一步合成中，通常会产生诸如亚磷酸根、磷酸根、1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸、1-羟基-3-甲胺基-亚丙基二膦酸等杂质[5-6]。伊班膦酸钠和这些杂质的结构皆没有发色基团，也不具备电化学活性，故不能用常规的紫外、荧光或电化学分析方法检测。目前报道伊班膦酸钠及伊班膦酸钠注射液中有关物质检测方法的文献较少，且未见同时检测N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐、亚磷酸、杂质B、杂质D、磷酸、杂质G、N-去甲基杂质，并能排除氯离子、碳酸根、硫酸根干扰的报道[7-15]。本文建立了离子色谱抑制法同时测定伊班膦酸钠原料药中7 个有关物质的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

离子色谱仪Thermo IC5000，包括自再生抑制器（Dionex AERS 500），电导检测器，进样器（Dionex AS-DV）；十万分之一天平（MS205DU METTER TOLEDO），超纯水仪（Milli-Q）。

1.2 试药

对照品伊班膦酸（USP，批号：R013F0，纯度：99.9%）；N-去甲基杂质（批号：20161002-D，纯度：100%）、杂质G（批号：20181004-D，纯度：100%）、杂质D（批号：D-181101，纯度：100%）（A 制药股份有限公司）；杂质B（TLC，批号：2641-091A3，纯度：99.4%）；N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐（成都叮当时代科技有限公司，批号：DTYQ0605-13-D，纯度：100%）；亚磷酸、磷酸（中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Dionexionpac AS11-HC 色谱柱（4 mm×250 mm，9 μm）；AG11-HC 保护柱（4 mm×50 mm）；以100 mmol·L－1NaOH 为流动相A、水为流动相B，梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL·min－1；检测器：抑制性电导检测器；检测器温度：35℃；抑制器：Dionex AERS 500 4 mm；抑制器电流：110 mA；柱温：30℃；进样量：20 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液 取伊班膦酸原料药，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含伊班膦酸钠5 mg 的溶液，作为供试品溶液。

2.2.2 系统适用性溶液 取伊班膦酸钠对照品和磷酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成每1 mL 约含伊班膦酸5 mg、磷酸5 μg 的混合溶液，作为系统适用性溶液。

2.2.3 混合对照品溶液 精密称取伊班膦酸钠对照品和N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐、伊班膦酸N-去甲基、亚磷酸、磷酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成每1 mL 约含伊班膦酸5 µg、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐5 µg、伊班膦酸N-去甲基5 µg、亚磷酸10 µg、磷酸15µg 的溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 专属性考察

精密量取空白溶剂（超纯水）、伊班膦酸钠杂质B、N-去甲基杂质、杂质G、杂质D、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐、磷酸和亚磷酸适量，加超纯水溶解作为对应的定位溶液；取上述各溶液适量混合后作为混合定位溶液；另取样品溶液加入混合定位溶液进样20 μL，记录色谱图。见图1，结果表明：溶剂不干扰已知杂质和主成分的检出；各已知杂质之间、已知杂质与主成分之间的分离度均符合要求。

图1 专属性考察图谱Fig 1 Ion suppression chromatogram of specificity

2.4 强制降解试验

为考察本品可能的降解途径及拟订色谱条件对降解产物的检测能力，确定强制降解产物是否为已知杂质，本研究对原料进行了强制降解试验，样品制备方法见表2。取上述各供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图，强制破坏试验结果见表3及图2。

图2 伊班膦酸强制破坏试验Fig 2 Forced degradation of ibandronate sodium

表2 强制降解条件Tab 2 Forced degradation condition

表3 强制破坏试验结果Tab 3 Forced degradation

结果显示，本品在酸、碱、氧、高温和光照条件下均未产生较大未知杂质，且破坏条件足够强烈，远远超过本品储存条件，故未继续加剧破坏条件。且各破坏条件下，杂质与主成分峰之间的分离度均大于1.5，表明拟订的色谱条件能够满足各已知杂质及降解产物的有效检出及分离。

2.5 检测限（LOD）和定量限（LOQ）

精密量取“2.2”项下对照品混合液适量，逐级稀释，以信噪比（S/N）约为3 时的进样浓度为其检测限（LOD），以信噪比（S/N）约为10 时的进样浓度为其定量限（LOQ），并平行配制6 份进行检测。

以拟订供试品浓度5 mg·mL－1，进样体积为20 μL 时，各杂质的检出能力均低于绝对进样量的0.02%（限度的20%），各杂质的定量限均小于报告限（本品的最大日剂量小于2 g，根据ICH的要求，原料有关物质的报告限为0.05%）。

2.6 线性关系考察

按“2.2.3”项下方法配制每1 mL 约含伊班膦酸N-去甲基杂质、杂质B、杂质D、杂质G、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸各50 µg、磷酸150 µg 和亚磷酸100 µg 的混合溶液，作为线性储备液；精密量取线性储备液逐级稀释，制成系列杂质线性溶液。精密量取上述各线性溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表4。

表4 标准曲线、线性范围、检测下限和定量下限Tab 4 Regression equation，linearity，LODs and LOQs

2.7 精密度考察

量取对照品溶液按“2.1”项下方法测定，连续进样6针，记录色谱图，考察进样精密度，结果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐、亚磷酸、杂质B、杂质D、磷酸、杂质G、N-去甲基杂质色谱峰面积的RSD分别为0.34%、0.21%、3.0%、0.23%、0.17%、1.2%、0.40%，表明方法精密度良好。

2.8 重复性考察

按“2.10”项下方法配制100%的加标供试品溶液，平行配制6 份。照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算每份样品中已知杂质的含量。结果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐含量RSD为2.6%；亚磷酸的含量RSD为1.1%；杂质B 的含量RSD为1.9%；杂质D 的含量RSD为1.81%；N-去甲基杂质的含量RSD为1.3%；磷酸的含量RSD为1.8%；杂质G 的含量RSD为0.72%，说明拟定的检测方法重复性符合要求。

2.9 稳定性考察

参照“2.10”项下方法配制对照品溶液与加标供试品溶液，在室温下放置不同的时间，进样测定，考察各溶液的稳定性。结果表明室温条件下，对照品溶液放置12 h，各杂质峰面积RSD小于3.0%，稳定性良好；供试品溶液放置12 h，各杂质峰面积RSD小于3.0%，稳定性良好。

2.10 回收试验

取伊班膦酸钠原料约50 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，分别精密加入“2.4”项下线性储备溶液适量，制成含限度浓度50%、100%、150%的加标供试品溶液，每个浓度平行制备3 份，照“2.1”项下色谱条件进行检测，结果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸盐酸盐、亚磷酸、杂质B、杂质D、磷酸、杂质G、N-去甲基杂质的平均回收率均在93.48%～100.30%，RSD在1.2%～5.5%。

2.11 样品测定

取伊班膦酸钠原料按照拟订的检测方法测定，结果见表5。

表5 伊班膦酸钠中有关物质检测结果Tab 5 Detection of related substances in ibandronate sodium

3 讨论

伊班膦酸钠原料药中存在较多的阴离子，故采用梯度洗脱的方式，即改变流动相中氢氧化钠溶液的浓度，使各杂质之间、杂质与主成分之间分离度均能达到要求；且在预试验中发现，采用100 mmol·L－1NaOH-水（22∶78）等度洗脱，除杂质G 外，其余各峰峰形和分离度良好；杂质G 峰形一般且响应较低；杂质D 峰拖尾；故用梯度优化杂质G 的峰形。氢氧化钠溶液的浓度梯度由初始的16 mmol·L－1增加至45 mmol·L－1时，各杂质与主峰间能够达到分离要求，各阴离子峰之间均无干扰。

本文采用阴离子交换-抑制电导方式进行检测，不仅可以得到很低的背景电导，提高检测灵敏度，而且样品前处理简单，只需溶解稀释即可进样分析。