肉苁蓉复方颗粒对大鼠骨质疏松症的治疗作用

徐双华，吴清（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.北京中京丰创科技有限公司，北京 100070）

骨质疏松症是一种内分泌、营养、免疫、遗传多种复合因素引起的代谢性疾病，大部分患者属于原发性骨质疏松，主要是因年龄增加所致，在老年人、绝经后妇女和恶性肿瘤患者中发生率较高。因此，研究防治骨质疏松的药物极为重要。

研究表明，肉苁蓉能提高性激素水平[1-2]、促进骨形成[3-5]、抑制骨吸收[6]；菊粉可以增加钙结合蛋白的表达与磷的生物利用度、提高钙吸收与全身骨骼矿物质参数[7-8]；硫酸软骨素能促进成骨细胞增生和新骨形成[9]。本研究将肉苁蓉、菊粉与硫酸软骨素组成复方制剂，研究以去卵巢所致骨质疏松大鼠为对象，观察由上述复方制剂增加动物骨密度及相关蛋白表达的效果，为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。

1 材料

肉苁蓉（经北京中医药大学鉴定为肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma），菊粉（比利时BENEO ORAFTI），硫酸软骨素钠片（四川省尚善堂制药有限公司），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司），戊酸雌二醇（拜耳医药保健有限公司广州分公司），骨钙素（BGP）试剂盒（上海联硕生物科技有限公司），碱性磷酸酶（ALP）ELISA 试剂盒（上海联硕生物科技有限公司），BMP-2 抗体（北京四正柏生物科技有限公司，4AK201716F），组织蛋白酶K（CK）试剂盒（上海远慕生物科技有限公司），脱氧吡啶啉（DPD）ELISA 检测试剂盒（上海研域仪器设备有限公司），白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），戊巴比妥钠（德国默克公司，批号：20160411），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（上海颖心实验室，批号：TX20149）。NORLAND-Stratec 周围型双能X 线骨密度仪（北京迈尔思瀛海威医疗技术有限公司）；离心机（北京京立离心机有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

Wistar 大鼠[北京维通利华动物技术有限公司提供，SPF 级健康雌性大鼠，实验单位使用许可证号：SYXK（京）2010-0025]，体质量（300±20）g。所有动物均放置于恒温、清洁的环境中。温度（22±2）℃，相对湿度（65±5）℃，光照12 h，黑暗12 h，动物自由摄食、摄水。

2 方法

2.1 肉苁蓉复方颗粒的制备

肉苁蓉200 g，粉碎，按照料液比1 ∶20 加入提取液（70%乙醇），在50℃条件下，提取时间为50 min，重复提取两次，提取液回收溶剂并浓缩，烘干得到肉苁蓉浸膏，与300 g 菊粉、硫酸软骨素25 g 混合均匀后，通过传统的湿法制粒制成颗粒。

2.1 大鼠骨质疏松模型的建立

将大鼠按体质量随机分为6个组，每组10只，分别为假手术组（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），去卵巢模型组（0.5%CMC-Na，10 mL·kg－1），戊酸雌二醇阳性对照组（1 mg·kg－1），肉苁蓉复方颗粒高、中、低剂量组1100、550、275 mg·kg－1（给药剂量分别为处方剂量的2 倍、1 倍、0.5 倍）。

手术前称重，按照30 mg·kg－1剂量，经腹腔注射戊巴比妥钠溶液实施麻醉，待大鼠麻醉起效后，腹位固定后于腹中线距阴道口3～4 cm 除去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约2～3 cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢，然后将卵巢下端输卵管用丝线结扎，切除双侧卵巢，顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另侧卵巢。其中假手术组仅仅切除卵巢附近的部分脂肪组织，不结扎输卵管、不切除卵巢，缝合切口，再次消毒，术后腹腔注射青霉素钠，1 次·d－1，连续3 d，防止术后感染。术后大鼠的活动正常。术后观察7 d，然后开始每日下午灌胃给予对应药物，每周称重一次，12 周后大鼠灌胃结束。

2.2 检测指标

2.2.1 体质量 每周测定大鼠体质量一次，据此调整灌胃量。

2.2.2 股骨干质量测定 大鼠喂养12 周后处死，剥离出左、右股骨。取左侧股骨于105 ℃烤箱中烤至恒重，称定股骨干质量。

2.2.3 骨密度测定 用美国NORLAND-Stratec周围型双能X 线骨密度仪（PDEXA）测定右侧股骨重点及股骨远心端的BMD 值（g·cm－2）。

2.2.4 大鼠血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α的测定 给药12 周后，麻醉大鼠，腹部下部开口，暴露腹主动脉，使用一次性采血针与配套的采血管，与腹主动脉下部Y 字岔口处进针取血，每只大鼠约取5 mL 全血。室温静置4 h，使血液完全凝固，3500 r·min－1离心10 min，取血清。按照试剂盒说明，测定血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6 和TNF-α水平。

2.2.5 BMP-2 表达的测定 留取完整的右股骨段，并迅速投入液氮中，后转移至－80℃保存，用于提取蛋白；用裂解液超声提取总蛋白后，Western blot 法测定BMP-2 表达。

2.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料采用方差分析方法，均以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体质量及骨参数变化

如表1所示，相比较于模型组，肉苁蓉复方颗粒高剂量组、中剂量组（P＜0.01，P＜0.05）大鼠体质量增加量显著降低，表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组对雌激素缺失导致骨髓间质细胞转化为脂肪细胞，具有良好的抑制作用，其中肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组股骨干质量、BMD显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组具有提高大鼠BMD及股骨干质量的作用。

表1 肉苁蓉复方颗粒对骨参数的影响Tab 1 Effect of cistanche compound granules on the bone parameters

3.2 大鼠血清指标变化

3.2.1 血清中ALP、BGP 水平 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加ALP 和BGP 的分泌，其在血清中含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组大鼠血清ALP 和BGP 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明高、中剂量肉苁蓉给药组能够有效地逆转ALP 和BGP升高的趋势，起到治疗骨质疏松的作用。阳性对照组大鼠的ALP（P＜0.05）和BGP 显著降低（P＜0.01）。

表2 肉苁蓉复方颗粒对血清ALP、BGP 的影响Tab 2 Effect of cistanche compound granules on serum ALP and BGP

3.2.2 血清中CK 和DPD 含量变化 如图1所示，与模型组比较，阳性对照组、肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的CK 和DPD 酶活力水平显著性降低（P＜0.05，P＜0.01），肉苁蓉复方颗粒通过抑制CK 和DPD 酶的活力，从而抑制骨吸收。

图1 肉苁蓉复方颗粒对组织蛋白酶（A）和DPD（B）的影响Fig 1 Effect of cistanche compound granules on serum CK（A）and DPD（B）

3.2.3 血清中IL-6 和TNF-α含量变化 如图2所示，与模型组比较，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的IL-6、TNF-α水平减少（P＜0.01），抑制水平接近阳性对照组，表明肉苁蓉复方颗粒通过调节IL-6、TNF-α的表达，降低破骨细胞增殖，抑制骨吸收。

图2 肉苁蓉复方颗粒对IL-6（A）及TNF-α（B）的影响Fig 2 Effect of cistanche compound granules on serum IL-6（A）and TNF-α（B）

3.3 大鼠BMP-2 蛋白表达

如图3所示，骨组织中可检测到BMP-2 蛋白表达，模型组的蛋白条明显低于假手术组，说明去势大鼠的BMP-2 表达减少，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组BMP-2 蛋白表达高于模型组，接近阳性对照组，说明肉苁蓉复方颗粒可增强BMP-2蛋白表达，其中中剂量组的效果最好。

图3 各组大鼠骨组织中BMP-2 蛋白表达图Fig 3 Expression of BMP-2 protein in the bone tissues of rats in different groups

4 讨论

去势大鼠骨质疏松模型是研究动物骨质疏松采用的一种模型，去卵巢大鼠是研究绝经后妇女骨质疏松的一个常用动物模型，具有手术简单，重复性、稳定性好等优点[10]。因此，采用此模型能比较客观地评价肉苁蓉复方颗粒对骨质疏松症的治疗作用。

在肉苁蓉复方颗粒对骨参数的影响实验中，模型组大鼠骨密度明显下降，破骨细胞和成骨细胞无法保持平衡，骨量快速丢失。通过肉苁蓉复方颗粒进行治疗后，可显著提高骨密度、股骨干质量，改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态，抑制骨量的继续丢失。

ALP 作为成骨细胞分泌物，其与血液中的钙离子相互作用，促进骨质的合成，可反映成骨细胞的活性[1，11]，ALP 促进有机磷酸化合物分解为无机磷酸离子，使磷酸离子与钙离子结合沉淀于骨内，BGP 也是由成骨细胞分泌，是骨形成和骨重建的反映指标之一[12-13]，两者均可反映成骨细胞的活性[14-15]，ALP 和BGP 水平越高，说明体内越缺钙[16]。本研究中，通过手术去卵巢处理，构建骨质疏松大鼠模型，发现模型组大鼠ALP 和BGP 含量升高，而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低其含量，说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以有效调节骨代谢平衡，抑制骨吸收，治疗骨质疏松。

BMP2/Smad 信号通路可以调控成骨细胞的全部过程，其功能障碍会引起骨量降低和骨形成减少，导致骨质疏松症发生[17]。BMP2 是经典BMPs/Smad 通路的重要配体[18-20]，BMP2 是BMPs 家族中非常重要的一个亚型，其可以刺激间充质干细胞分化为成骨细胞，促进成骨细胞转化为骨细胞，是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的重要的信号分子之一[21-23]。本研究中，发现模型组大鼠的BMP-2 蛋白表达明显降低，说明BMP2/Smad 通路的信号传递减弱，影响成骨细胞分化，进而影响骨密度水平，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以上调BMP-2 蛋白水平，蛋白表达水平接近阳性对照组，进而调节BMP2/Smad通路的信号传递，促进成骨细胞分化，起到治疗骨质疏松的作用。

CK 是组织蛋白酶溶酶体蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶成员。它被认为可降解骨基质蛋白，骨桥蛋白和骨粘连蛋白[24]，血清中的CK 是骨吸收的典型标志物[25]，其过度表达会增加松质骨转换，阻止CK 表达可抑制骨吸收，有利于骨基质的稳定性[26]。DPD 也是典型的骨吸收标志物[27-28]，当骨吸收作用增强，成熟的Ⅰ型骨胶原分解，DPD 作为降解产物被释放到血液中，DPD具有组织特异性，不受饮食影响，其只在骨吸收及骨溶解时才被释放入血。因此，血清DPD 水平升高，说明骨吸收增强[29]，本研究发现，发现模型组大鼠的CK 和DPD 含量升高，说明骨吸收增强，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以显著性降低CK 和DPD 含量，接近阳性对照组，抑制骨吸收，从而有效对抗骨质疏松的发生。

细胞因子IL-6、TNF-α是调节骨吸收的关键因素[30]，IL-6 作为一种生物活性因子，可通过多种方式参与到成骨细胞和破骨细胞的功能调控，是促进破骨细胞增殖分化的重要因子[31]，IL-6 可以通过SHP2/P13K/Akt2 和SHP2/MEK/ERK 通路抑制成骨细胞分化，TNF-α是促进骨吸收的细胞因子[32]，可作用于前体破骨细胞，使其分化为破骨细胞，促进破骨细胞生成，增强骨吸收。TNF-α还可通过影响OPG/RANKL/RANK 信号系统，以旁分泌的方式调节破骨细胞活化，刺激骨吸收[16]。本研究发现，模型组大鼠的IL-6、TNF-α水平显著升高，说明模型组大鼠骨吸收增强，骨质遭到破坏，而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低的IL-6、TNF-α水平，接近阳性对照组水平，说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以抑制大鼠体内IL-6、TNF-α的表达，通过影响SHP2/MEK/ERK、SHP2/P13K/Akt2 和OPG/RANKL/RANK 通路，降低破骨细胞增殖，抑制骨吸收，有效治疗骨质疏松。

近年来，许多研究证明补肾类中药在治疗老年性骨质疏松症的研究中取得了较满意的结果，本方针对中老年人全身性骨量减少，骨密度损失及骨组织的微观结构退化所致的骨脆性增加、骨密度降低、骨折危险性增加的特点，选用具有补肾壮阳、补精益髓功效的肉苁蓉，辅以具有促进钙和矿质吸收，降低骨代谢过程作用的菊粉及促进成骨细胞增生和新骨形成的硫酸软骨素，有效改善了去卵巢大鼠骨质疏松的状态，为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。