外泌体miR-155通过调节SOCS1影响重症急性胰腺炎肺损伤

缪宝洲，汪敬恒，钟俊峰，潘恩，林秀丽

福建中医药大学附属福鼎市医院重症医学科，福建福鼎355200

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是ICU常见疾病，随着生活方式的改变，发病日趋年轻化[1-2]。重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）患者伴有或者不伴有多脏器功能衰竭（mutiple organ failure,MOF），决定了其严重程度，尤其是急性肺损伤（acute lung injure,ALI）[3]和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）[4]。外泌体排出细胞外并携带核酸传递信息，可穿透血管壁，同时可穿透细胞外基质[5]，其中MicroRNA即为外面运输核酸之一，从而影响下游基因表达[6-7]。SAP-ALI的内皮细胞通透性发生改变，可能导致外泌体的分泌增多，携带MicroRNA增多[8]。

AP发生发展过程中，胰液的释放会导致胰腺自我消化[9]，从而产生IL-17的CD4+T辅助细胞（Th17）的积聚[10]。文献中已经证实SOCS1调节STAT5，STAT5是Treg细胞的统计调节器[11]。Wang等[12]人研究发现，miR-155可以抑制SOCS1，从而影响AP的发生发展过程。设想miR-155通过外泌体包裹转运可以通过SOCS1影响SAP-ALI的过程。因此该文方便选取福建中医药大学附属福鼎医院重症医学科（ICU）2019年1—12月收治入院的128例急性胰腺炎患者血浆进行了相关研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

方便选取福建中医药大学附属福鼎医院重症医学科（ICU）收治入院的128例急性胰腺炎患者血浆，其中急性胰腺炎伴肺损伤（AP with ALI,AWA）35例，急性胰腺炎不伴肺损伤（AP without ALI,AOA）93例，采集8名非患者志愿者血浆，年龄39~53岁。根据伴有或者不伴有ALI将患者分成两组，AWA组35例，男女比例为17例∶18例，平均年龄为（48.6±16.1）岁；AOA组93例，男女比例为44例∶49例，平均年龄（45.6±16.5）岁。采集8名非患者志愿者血浆，平均年龄（46.3±4.17）岁。签署知情同意书后，经过福建中医药大学附属福鼎医院伦理委员会论证通过，伦理委员会批准文号：鼎医综〔2020〕124号。外泌体大体试剂盒：德国QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集因胰腺炎急诊入院的患者外周血3~5 mL，抗凝，至实验室离心，低速1 000 g，10 min。取上层血浆至1.5 m LEP管，分装做好标记，-80℃保存备用。

1.2.2 提取外泌体将标本从储存管中取出，用200 mL XBP缓冲液与血浆等体积混合，收集混合液体，注入exoEasy滤柱中离心。使用PexoEasy滤柱加入缓冲液后离心。在滤网膜上，室温孵育1 min。离心，5 000 g，5 min，备用。

1.2.3 提取RNA加入400 μl酸化酚氯仿，通过震荡方式进行混匀，时间30~60 s。混匀后加入20 μl外部参照cel-miR-39(5 pmol/L)。纯乙醇萃取离心结束。洗涤，离心条件为室温9 500 g，空转1 min后弃去收集管，用新的收集管将洗脱液预热至95℃。预热好洗脱液后加入滤膜中，根据上述条件再离心30 s，回收收集管内滤液。检测收集到的溶液。

1.2.4 进行miR-155的荧光定量检测 以U6为内参基因，U6及miR-155特 异 引 序 列 为，miR-155:Forward primer:5'-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3'，Reverse primer:5'-CATCACAGACCTGTTATTGC-3'；内 参U6:Forward primer:5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3'，Reverse primer:5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3'。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，PCR以celmiR-39作为外源性参照，miR-155相对表达量计算公式45-Ct=45-（CtmiR-155-CtmiR-39）。miR-155结果中，每个样本设置3个重复，取算术平均值。计量资料以（±s）表示，组间差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定

Western blot结果提示，β-actin未在外泌体检测出，外泌体未被污染；外泌体组，TSG101和CD81特异性标志物表达升高，外泌体分离成功，见图1A。用细胞摄取动态光散射分析，发现外泌体平均直径为（80.69±18.11）nm，同时证实外泌体具有膜结构呈囊泡状，见图1B。

图1 外泌体鉴定：A.western blot结果显示TSG101和CD81表达；B.外泌体的形态

2.2 3组血浆外泌体miR-155水平比较

AWA患者血浆外泌体miR-155的相对表达量为（15.11±2.18），AOA患者血浆外泌体miR-155的相对表达量为（10.64±1.65），非患者志愿者（NC）血浆外泌体miR-155的相对表达量为（5.19±0.44）。AOA组血浆外泌体miR-155水平显著高于健康志愿者（P＜0.01）；AWA组血浆外泌体miR-155水平显著高于AOA组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 外泌体miR-155在AWA患者血浆中的表达情况

2.3 miR-155直接靶点SOCS1的确定

为了研究miR-155的潜在靶基因，利用targetscan软件进行了生物信息学分析。使用这种方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中预测miR-155结合位点，见图3A。为了检测miR-155对SOCS1的调节作用，对CD4+T细胞进行了双荧光素酶报告试验。细胞共转染了野生型（WT）或突变型（MUT）SOCS13’-UTR质粒和miR-155或对照miR转染。MiR-155显著抑制WT的荧光素酶报告活性，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但不抑制MUT-SOCS13’-UTR，表明SOCS1是MiR-155的直接靶点（图3B）。RT-PCR分析miR-155转染细胞中的SOCS1，证实miRNA下调了CD4+T细胞中SOCS1的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3，用miR-155抑制剂处理细胞可逆转这种作用，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3C。

图3 miR-155直接靶点SOCS1的确定。A.miR-155和SOCS1 mRNA的序列匹配；B.WT或MUT SOCS1 3’-UTR与miR-155或对照miR共转染的荧光素酶检测报告；C.转染后3天CD4+T细胞SOCS1的Rt-PCR分析

2.4 3组血浆CD4+T细胞中SOCS1表达情况比较

为探讨miR-155对AP和ALI的作用机制，进一步研究了不同分组中CD4+T细胞的SOCS1的表达情况。研究结果发现，AWA组较AOA组，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。AOA组较正常组，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 western blot实验和实时定量PCR实验

3 讨论

目前AP的诊断包括两个方面，临床表现和实验室检查，但尚无准确预测AP严重程度的标志物，此标志物需要时间准确性，即必须在早期发现并准确预测。miR-155参与了多种疾病的发生发展[13]，在某些胰腺疾病中，如星状细胞通过相关机制转化时，miR-155表达下调[14]。该课题依据以上调查基础，采集AP患者血浆并分离纯化鉴定血浆外泌体，研究发现外泌体miR-155在AWA患者血浆中显著高表达，AWA患者相对表达量为（15.11±2.18），AOA患者相对表达量为（10.64±1.65），NC组相对表达量为（5.19±0.44）。AWA组血浆外泌体miR-155水平是AOA组的1.5倍，是NC组的3倍，这从侧面提示miR-155可能以外泌体形式存在于血浆中，并与AP的病情发展有一定的关系。Jiménez等[15]人发现，AP能够产生2个不同的外泌体群，它们在细胞分布、蛋白质和miRNA含量上存在相应的差异，并且可以产生不同的生理效应。其中一个即miR-155明显升高为特点，且miR-21和miR-122降低，其中AP组外泌体miR-155是对照组的4倍，而该文结果中AWA是NC组的3倍，结果相近，与该研究结果相符。说明外泌体miRNA的异常表达，会对疾病产生较大影响，结果显示，miR-155在AWA患者血浆外泌体中高表达。

那么外泌体miR-155通过什么途径对AP的严重程度发挥作用？有研究显示，miR-155可通过靶向结合SOCS1发挥抗肿瘤作用，Zhang等[16]发现，miR-155通过直接靶向SOCS1促进间变性甲状腺癌的进展，其研究结果表明，荧光素酶实验验证了miR-155和SOCS1的靶向结合作用，同时能够抑制甲状腺癌细胞中SOCS1的表达，降低其表达后从而造成肿瘤进展。该研究进一步研究了miR-155与SOCS1的关系，利用targetscan软件进行了生物信息学分析。使用这种方法，在3’-UTR的SOCS1 mRNA中预测miR-155结合位点（图3A）。为了检测miR-155对SOCS1的调节作用，对CD4+T细胞进行了双荧光素酶报告试验，结果发现miR-155通过抑制性结合SOCS1 mRNA达到抑制其表达（图3C），对照组明显高于miR-155组，约为3倍，得到了与Zhang等人的研究类似的结果。同时进行不同分组之间SOCS1的表达情况分析，结果发现，AWA组较AOA组，SOCS1在蛋白和mRNA水平均明显降低（P＜0.05），如图4所示。AOA组较NC组，SOCS1在蛋白和mRNA水平也均明显降低（P＜0.05），与外泌体miR-155的表达呈负相关。通过以上结果，推论可以发现，SOCS1参与了AP的发生发展过程，外泌体miR-155通过抑制性结合SOCS1的3’TUR来抑制其表达，影响AP的病程进展。在Wang等[12]的研究中，在胰腺炎中已经证实miR-155可以靶向结合SOCS1并通过这一调节轴对Th17/Treg比率进行调节，SOCS1的表达情况与胰腺炎的严重程度相关，与该研究结果一致。综上所述，外泌体miR-155可以作为预测AP病程进展的标志物，值得进一步深入研究。

外泌体miRNA在近些年研究中呈现明显的应用优势，尤其在重症疾病中，包括胰腺炎、肿瘤、肾纤维化等方面。该研究确定了SOCS1是miR-155的直接靶向结合目标，外泌体源性miR-155在AWA患者血浆中高表达，其可通过调节SOCS1的表达影响重症急性胰腺炎肺损伤，为外泌体在重症胰腺炎方面的研究打下基础。但对其机制仍所知甚少，如外泌体源性miR-155如何发生上调，如何发生下调，是否可以确定界定值范围，来判断疾病进展情况，需要继续深入研究。

综上所述，外泌体源性miR-155的表达水平与重症胰腺炎患者的发病情况息息相关，使得它对于疾病的预后判断十分重要，有望成为诊断和提示预后的生物标志物。因此可进一步对miR-200c的发展潜力进行挖掘，从而更好的为临床服务。