野生杜鹃林土壤低分子量有机酸分布特征*

许塔艳 全文选 李朝婵,2 潘延楠 谢利娟 郝江涛 高永道

(1.贵州师范大学贵州省山地环境重点实验室 贵阳 550001； 2.中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室贵阳 550081； 3.深圳职业技术学院建筑工程学院 深圳 518055)

低分子量有机酸作为可溶性有机碳存在于土壤环境中，是一类具有一至数个羧基的小分子有机物，包括脂肪族和芳香族(宋金凤等, 2008; Kpomblekouetal., 2003)。森林土壤中大量凋落物的分解、淋溶，微生物代谢产物和根系分泌物是土壤有机酸的重要来源(Lingetal., 2009; Gaoetal., 2010)。而土壤有机酸的类型和数量因土壤类型、植被类型、营养状况、土壤微生物数量而变化，处于合成和分解的动态过程，其浓度一般不高，为微摩尔至毫摩尔数量级(Jones,1998; Taghipouretal., 2012)。植物根际属于特殊的微环境，由于根系分泌大量的有机酸以及分泌质子引起产酸细菌的繁殖生长，其低分子量有机酸含量可达1～10 mmol·L-1，明显高于本体土壤(丁永祯等, 2005)。低分子有机酸作为一种调节物质，通过电离H+、配位交换和络合作用溶解和转化土壤中的难溶性养分，促进土壤养分的生物有效性(丁永祯等, 2005; Taghipouretal., 2012; 金彩霞等, 2013)，通过官能团与金属元素发生络合或螯合作用，活化金属元素，促进植物生长发育。土壤pH、温度、含水量、微生物活性及有机物种类和含量等都会影响土壤低分子量有机酸的组成和含量，从而影响其活化效果(van Heesetal., 2005)。房莉等(2007)采用化学浸提法研究酸性森林马尾松(Pinusmassoniana)林和杉木(Cunninghamialanceolata)林土壤中磷的活化效果，结果表明低分子量有机酸能显著活化森林土壤中的惰性磷，其中柠檬酸活化效果最佳。同时有机酸在降解植物体内金属元素毒害、修复重金属污染土壤、迁移和转化有机污染物等方面发挥重要作用(Dingetal., 2011)。

土壤低分子量有机酸影响植物化感作用，特定的环境条件下有机酸的累积可能对植物生长产生毒害(Kpomblekouetal., 2003)。研究表明，长链脂肪酸和有机酸为杜鹃混交林腐殖质层和土壤表层的主要化感物质种类，可能是群落天然更新的主要障碍因素之一(李朝婵等, 2018; Lietal., 2019)。本研究通过对贵州百里杜鹃国家森林公园内5种林分类型常绿混交马缨杜鹃(Rhododendrondelavayi)林、常绿混交露珠杜鹃(R.irroratum)林、常绿混交迷人杜鹃(R.agastum)林、常绿阔叶混交林、落叶阔叶混交林的表层土壤有机酸物质分布特征进行分析，探讨不同林分土壤中有机酸的分布差异性，为研究野生杜鹃林林分土壤管理提供基础数据。

1 研究区概况

百里杜鹃国家森林公园位于贵州西北部黔西县和大方县交界处(105°50′16″—106°04′57″E，27°10′07″—27°17′55″N)，海拔1 060～2 121 m，年均相对湿度为84%。小气候温凉湿润，年平均积温4 200 ℃，最冷月(1月)均温为2 ℃，最热月(7月)均温21 ℃，极端最高温度32 ℃，极端最低温度为-9.3 ℃。年降水量1 000～1 100 mm，春夏降水量占70%，水热同季。全年多阴少晴，云雾多，日照时数仅1 335.5 h。百里杜鹃国家森林公园内形成了以马缨杜鹃、迷人杜鹃、露珠杜鹃等为优势树种的林分类型以及常绿阔叶混交林、落叶阔叶混交林等林分类型，是迄今为止中国已查明的面积最大的原生杜鹃混交林，也是全国唯一以保护杜鹃花科(Ericaceae) 杜鹃属(Rhododendron)植物为对象的自然保护区。

2 研究方法

2.1 样品采集与处理

在百里杜鹃国家森林公园内的常绿混交马缨杜鹃林、常绿混交迷人杜鹃林、常绿混交露珠杜鹃林、常绿阔叶混交林及落叶阔叶混交林林分，每个林分设置样地2个，共10个样地(海拔1 647～1 684 m)采集土壤样品。常绿混交马缨杜鹃林、常绿混交迷人杜鹃林、常绿混交露珠杜鹃林内常绿杜鹃占林分树种数量的65%以上，常绿阔叶混交林的主要树种有马缨杜鹃、迷人杜鹃、露珠杜鹃和其他伴生树种，落叶阔叶混交林以白栎(Quercusfabri)、山矾(Symplocossumuntia)、青冈(Cyclobalanopsisglauca)等树种为主(表1)。各个林分中主要的树种为： 常绿混交马缨杜鹃林伴生种乔木层有迷人杜鹃、青冈、臭椿(Ailanthusaltissima)，灌木层有火棘(Pyracanthafortuneana)、楤木(Araliachinensis)等； 常绿混交迷人杜鹃林伴生种乔木层有马缨杜鹃、青冈、山矾，灌木层有算盘子(Glochidionpuberum)、杜鹃(Rhododendronsimsii)等； 常绿混交露珠杜鹃林伴生种乔木层有山矾、杉木、青冈、马缨杜鹃、迷人杜鹃，灌木层有算盘子、杨梅(Myricarubra)等； 常绿阔叶混交林乔木层有山矾、杉木、青冈、亮叶桦(Betulaluminifera)、马缨杜鹃、迷人杜鹃、露珠杜鹃，灌木层有算盘子、杜鹃等； 落叶阔叶混交林乔木层有白栎、山矾、青冈、杨梅、栗(Castaneamollissima)、响叶杨(Populusadenopoda)、臭椿，灌木层有楤木、算盘子、铁海棠(Euphorbiamilii)、南烛(Vacciniumbracteatum)、平枝栒子(Cotoneasterhorizontalis)、金丝桃(Hypericummonogynum)等。

表1 不同林分样地基本情况Tab.1 The general situation of different forest structure plots

每个样地设置3个5 m× 5 m样方，土壤取样深度为0～10 cm，采用5点法取样。将3个样方的土壤进行混合后带回实验室，自然晾干后，挑去石块、残体，采用四分法进行分量后对每个样地土壤研磨，过100目筛后备用。取1 g土壤样品，各3份，于20 mL棕色瓶中，加5 mL 0.1% 磷酸溶液置于25 ℃、恒温培养振荡器中振荡24 h，于2 mL离心管中在6 000 r·min-1转速下，离心10 min。取上清液过0.22 μm水相微孔滤膜，保存于4 ℃冰箱，每组试验3次重复。土壤相对含水量测定采用烘干法，土壤pH测定采用电位法(水土体积质量比为2.5∶1)(鲁如坤， 2000)。

2.2 仪器与试剂

日本岛津LC-10A高效液相色谱仪(HPLC)，日本资生堂CAPCELL PAK C18分析柱(4.6 mm× 250 mm，5μm)，TLE204万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，KDC-140HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，ZWY-211B恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)。

草酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、丁二酸、酒石酸和甲酸8种标准品(色谱纯，购于Sigma公司)，甲醇(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，磷酸(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)，试验用水均为超纯水，0.22 μm水相针式过滤器。

2.3 液相色谱条件

检测色谱柱为CAPCELL PAK C18分析柱，流动相为甲醇(A)和 0.1%磷酸溶液(B)(体积比为4∶96)，均经0.45 μm微孔滤膜过滤。检测条件参考Lu等(2007)的方法并加以改进，检测波长210 nm，柱温箱温度为40 ℃，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL，检测时间15 min。分别采用标准品色谱保留时间定性，以峰面积进行定量。

2.4 数据处理与分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行方差分析及Pearson相关性分析；利用Origin8.0绘制柱状图，R3.5.2统计软件绘聚类热图。

3 结果与分析

3.1 不同林分类型土壤有机酸差异特征

8种有机酸在5种林分土壤样品中均能检出，其中草酸的含量明显高于其他有机酸(图1)。从5种林分土壤有机酸的总量上看，落叶阔叶混交林土壤中的有机酸总量最高，为276.67 μg·g-1，而常绿混交迷人杜鹃林土壤中有机酸总量最低，为159.95 μg·g-1，土壤有机酸总量大小顺序为： 落叶阔叶混交林>常绿混交露珠杜鹃林>常绿混交马缨杜鹃林>常绿阔叶混交林>常绿混交迷人杜鹃林，有机酸含量高低顺序依次为： 草酸>酒石酸>柠檬酸>苹果酸>乳酸>乙酸>甲酸>丁二酸。由图1可知，草酸为不同土壤中的主要有机酸，其中常绿混交马缨杜鹃林土壤中草酸含量占49%，常绿混交迷人杜鹃林为52%，常绿混交露珠杜鹃林为56%，常绿阔叶混交林为58%，而落叶阔叶混交林为74%，甲酸、乙酸和丁二酸在各林分中含量都较低，不超过总量的10%。

图1 不同林分类型土壤低分子量有机酸组成比例Fig. 1 Percentage of low molecular weight organic acids composition in soils under different stand types

3.2 不同林分类型土壤有机酸与土壤pH相关性分析

落叶阔叶混交林土壤中的草酸含量与其他4种林分土壤差异显著，常绿混交马缨杜鹃林土壤中草酸与常绿混交露珠杜鹃林、常绿混交迷人杜鹃林差异显著，常绿混交迷人杜鹃林与常绿混交露珠杜鹃林差异显著(图2a)(P<0.05)； 常绿混交马缨杜鹃林土壤中的酒石酸与常绿阔叶混交林和落叶阔叶混交林差异显著(图2b)(P<0.05)； 常绿混交露珠杜鹃林土壤中的甲酸和乳酸含量与常绿混交马缨杜鹃林、常绿混交迷人杜鹃林和常绿阔叶混交林差异显著(图2c、e)(P<0.05)； 常绿混交迷人杜鹃林土壤中的苹果酸含量与落叶阔叶混交林差异显著(图2d)(P<0.05)； 落叶阔叶混交林土壤中的乙酸含量与其他4种林分土壤差异显著，常绿混交迷人杜鹃林与常绿阔叶混交林差异显著(图2f)(P<0.05)； 常绿混交马缨杜鹃林土壤中柠檬酸含量与其他4种林分土壤差异显著，常绿混交露珠杜鹃林与常绿混交迷人杜鹃林、常绿阔叶混交林和落叶阔叶混交林差异显著，常绿混交迷人杜鹃林与落叶阔叶混交林差异显著(图2g)(P<0.05)； 丁二酸在5种林分土壤中无显著差异(图2h)。土壤pH在不同林分土壤中差异显著(图2i)(P<0.05)。由此可知，不同林分土壤有机酸含量分布特征和土壤pH具有显著差异。

不同林分土壤理化指标之间存在着密切的相关关系(表2)。其中，草酸与苹果酸极显著正相关(P<0.01)，与乙酸显著正相关(P<0.05)。酒石酸与柠檬酸显著正相关(P<0.05)。苹果酸与乙酸显著正相关(P<0.05)。酒石酸与pH极显著负相关(P<0.01)，柠檬酸与pH显著负相关(P<0.05)。土壤相对含水量与各个土壤理化指标均存在一定的相关性，与草酸显著负相关，与其他有机酸之间未达到显著水平。

3.3 不同林分类型土壤有机酸的聚类分析

分别对5个不同林分类型土壤的8种有机酸物质进行多元统计，采用Z-score标准化方法通过R软件生成聚类热图(图3)。热图纵向有机酸各组分的聚类树显示，有机酸可以分为2大类： 第1类为丁二酸、甲酸、乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸和酒石酸，其主要特征是土壤中这7种有机酸含量明显较低，只有常绿混交迷人杜鹃林土壤中的酒石酸、常绿混交马缨杜鹃林土壤中的柠檬酸、酒石酸含量高于平均值； 第2类为草酸，其含量明显高于平均值，主要特征是在各森林土壤中草酸均是优势酸。横向的聚类树显示，不同林分类型可以分为2大类： 第1类落叶阔叶混交林，主要特征是草酸含量最高，其他有机酸含量均低于中心值； 第2类为其他4类混交林，主要特征是草酸含量最高，其他有机酸含量均低于中心值。

4 讨论

4.1 森林土壤中有机酸的组成和来源

森林土壤中低分子量有机酸的来源十分复杂，包括有机质分解、植物根系分泌、微生物合成、大量凋落物及大气沉降等过程(丁永祯等, 2005)，不同植物土壤低分子量有机酸组成与含量的差异是物种的遗传背景、生长环境和培育措施等因素共同调控的结果(汪建飞等, 2006)。不同的森林植物分泌不同种类的有机酸，如阔叶落叶树、阔叶常绿树和灌木主要分泌柠檬酸，而针叶树主要分泌草酸(陈荣府等, 2015)； 北美森林土壤中主要含有草酸、柠檬酸、乳酸、甲酸、丙二酸(Dijkstraetal., 2001)。其他植物，如欧洲油菜(Brassicanapus)主要分泌柠檬酸和苹果酸(Xuetal., 2016)，而千穗谷(Amaranthushypochondriacus)主要分泌草酸(Fanetal., 2016)，蚕豆(Viciafaba)主要分泌草酸、酒石酸和柠檬酸(Zhanetal., 2016)。本试验中5种不同林分土壤低分子量有机酸的组成含量具有较大的差异性，这与Zhao等(2014)关于4种不同植物向土壤中分泌有机酸的结果相似。因此，不同植物森林土壤低分子量有机酸的组分和含量影响不同，这可能与不同森林植物向土壤分泌有机酸的种类及其代谢活动的差异相关。本研究选择的百里杜鹃5种林分类型为研究样地，土壤地质背景、环境条件较为一致，土壤有机酸组成与含量差异可能来自林分中优势物种的差异。有机酸释放后易被微生物降解、被土壤固相吸附(Hashimoto, 2007; Fujiietal., 2010)，暗棕壤中有机酸的吸附强度为草酸>柠檬酸>苹果酸，生物降解率草酸<苹果酸<柠檬酸，吸附作用影响生物降解率，当土壤中微生物可利用的有机酸耗尽后，有机酸的降解速率渐趋稳定(宋金凤等, 2007; van Heesetal., 2003)。本研究不同林分类型土壤中草酸含量最高，微生物降解作用可能影响了其他有机酸的含量。

4.2 森林土壤有机酸与土壤酸化

土壤酸化是指土壤中H+增加及盐基离子减少的过程(杨向德等, 2015)，它加速了土壤中大量营养元素的流失导致土壤退化。土壤呼吸形成的碳酸和动植物残体的分解产生的有机酸等都会致使土壤酸化(戴中民, 2017)。低分子量有机酸可以活化土壤中的养分元素(Chenetal., 2002)，养分元素的活化能够促进植物吸收、移出、减少土壤中的养分与盐基离子的含量，从而加剧酸性土壤的酸化(李平等, 2005)。有机酸与土壤混合会降低土壤pH，有机酸淋洗后土壤交换性盐基离子含量的增加是土壤缓冲有机酸酸化作用的一种表现(Fujiietal., 2008; Zhangetal., 2016)，盐基离子在调节土壤pH中起着核心作用(Lietal., 2008)。研究表明柠檬酸、苹果酸和草酸淋洗后各土层pH均比模拟酸雨淋洗后低，盐基离子的淋出总量是模拟酸雨处理的1.58～9.27倍，土壤低分子量有机酸比酸雨更容易加速土壤酸化(李平等, 2005)。柠檬酸、草酸、乙酸、酒石酸等降低杉木林土壤pH，致使土壤酸化(余健等, 2005)。杜鹃属植物喜凉爽湿润气候且疏松多腐殖质的酸性土壤，是典型的酸性土壤指示植物(廖菊阳等, 2010)。本研究中5种不同林分土壤中都有不同程度的有机酸积累，5种有机酸与土壤pH呈负相关关系，其中酒石酸与pH极显著负相关，柠檬酸与pH显著负相关，3种常绿混交杜鹃林的土壤pH显著低于常绿阔叶混交林和落叶阔叶混交林，常绿混交杜鹃林土壤中出现土壤酸化。马缨杜鹃植株适宜生长在pH在3.7～5.2的强酸性至极强酸性的土壤中，而迷人杜鹃和露珠杜鹃适宜在pH为6.0～6.4的弱酸性土壤中生长(吴士章等, 2009)。本研究结果表明，常绿混交马缨杜鹃林土壤pH值最低，且土壤中有机酸积累量较多，可能是有机酸的累积进一步加重了林区的土壤酸化。

4.3 森林土壤有机酸的化感作用

土壤低分子量有机酸累积到一定浓度水平可能会产生化感毒害作用(Kpomblekouetal., 2003)。土壤中有机酸的存在是损害种子发芽和生存能力的环境因素之一，其毒害作用与细胞壁降解、呼吸功能受抑制以及根系细胞分裂减少有关，有机酸直接与根系接触会损害根系发育(Armstrongetal., 2001; Tunesetal., 2013)。紫穗槐(Amorphafruticosa)浸提液中甲酸、酒石酸等有机酸协同作用抑制豆科植物种子萌发和幼苗生长(郭忠录等, 2010)； 邢素芝等(2007)发现柠檬酸和苹果酸溶液浸种对小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)种子萌发和幼芽生长均有抑制作用； 在淹水稻田土壤中的乙酸也会毒害稻苗生长发育(Angelesetal., 2006; Tunesetal., 2013)； 柠檬酸以浓度依赖的方式降低紫花苜蓿(Medicagosativa)种子发芽率(Agnelloetal., 2015)。欧洲品种(UC157)和美国品种(Gijinlim)芦笋(Asparagusofficinalis)，其分泌的潜在化感物质草酸、琥珀酸和酒石酸抑制轮作植物根和茎的生长，抑制根系对氮、磷等养分的吸收，表现出极强的品种化感作用和自毒作用(Yeasminetal., 2014)，其分泌物显著抑制芦笋的根长和芽长(Yeasminetal., 2013)。森林土壤中的低分子量有机酸含量和动态变化是开展有机酸化感作用及酸化森林土壤等机制研究的前提条件(金彩霞等, 2013)，根际土壤有机酸化感作用影响了受体植物根系生长发育，造成林下植物组成单一及分布稀疏(段剑等, 2016)。大树杜鹃(Rhododendronprotistumvar.giganteum)新鲜叶片具有明显的自毒效应，林下立地条件中的凋落物通过物理和化感作用影响其种子萌发和种群天然更新(刘芳黎等, 2017)。有机酸释放后易被微生物降解利用，表层土壤中的柠檬酸和草酸的降解速率高于乙酸(宋金凤等, 2008)，本研究中不同林分土壤中的草酸积累量最多，为各个林分类型的主要低分子量有机酸。前人研究表明，迷人杜鹃具有化感自毒作用，过厚的凋落物及其浸提液抑制迷人杜鹃种子的萌发和幼苗的天然更新(周艳等, 2015)。实地探查极少发现林下杜鹃幼苗生长，常绿混交杜鹃林和常绿阔叶混交林的枯落物厚度为5～15 cm，落叶阔叶混交林厚度仅为1～2 cm，3种常绿混交杜鹃林和常绿阔叶混交林林下幼苗数量明显少于落叶阔叶混交林。落叶阔叶混交林土壤有机酸的积累量明显多于常绿阔叶混交林。因此，采取林业措施降低土壤中有机酸的累积对于百里杜鹃杜鹃林分管理有着重要意义。

5 结论

不同林分类型土壤低分子量有机酸的组成和含量受到林分优势种的影响，其中草酸为主要土壤有机酸。不同林分土壤中有机酸的积累影响了土壤pH，酒石酸与pH呈极显著负相关，柠檬酸与pH呈显著负相关。土壤有机酸总量落叶阔叶混交林高于常绿混交露珠杜鹃林、常绿混交马缨杜鹃林、常绿阔叶混交林、常绿混交迷人杜鹃林，同时落叶阔叶混交林区别于其他林分类型的主要特征是草酸含量最高。