紫归长皮软膏促进大鼠难愈性创面修复及NGF分泌的研究

王永灵 蒉纲 廖明娟 李琰

难愈性创面是指各种原因导致的机体正常皮肤及组织损伤后，经正规治疗无法愈合的创面[1]。难愈性创面具有病因复杂、病程长、难于愈合等特点，给临床治疗带来极大的困难，且近年来发病率呈上升趋势[2]。中医中药治疗难愈性创面有悠久的历史，具有明显的疗效及特色。我院自制的紫归长皮软膏具有祛腐生肌、促进创面愈合的作用。本研究旨在观察紫归长皮软膏治疗大鼠难愈性创面的组织形态学变化，及组织内神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)的分泌情况，为临床采用该药治疗难愈性创面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只雄性清洁级SD大鼠，体质量160～205 g，平均(183.06±7.23) g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(沪)2008-0016。随机分为4组：正常空白组、模型空白组、紫归长皮软膏组和贝复济组，每组8只。

1.2 实验药物

贝复济(63 000 IU/瓶)，为珠海亿胜生物制药有限公司生产(批准文号：国药准字S10980077)；紫归长皮软膏(沪药制字Z05060611)，我院制剂室提供。0.9%生理盐水，上海长征富民金山制药有限公司生产(批准文号：国药准字H31021918)；氢化可的松琥珀酸钠(50 mg/支)，天津生物化学制药有限公司生产(批号：20101010)。

1.3 实验试剂与仪器

免疫组织化学-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法试剂盒(Zymed公司，美国)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(北京中山生物技术有限公司)、EnVision试剂(HRP/Rabbit)抗兔即用型(Dako公司，丹麦)、NGF一抗(兔抗鼠，分别为1∶100、1∶50稀释， Santa Cruz 公司，美国)、生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(Vector公司，德国)。

IMS细胞图像分析仪系统和医学图像分析软件(上海申藤信息技术有限公司)、摄像机(MV-CP410， Panasonic公司，日本)、光学显微镜(Olympus公司，日本)、切片机(RM2145， Leica公司，德国)、电热恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)。

1.4 造模方法

参考文献[3]的方法制备SD大鼠难愈性创面模型。除正常空白组常规饲养外，其余3组大鼠均连续3 d肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠(80 mg/Kg)，经血糖检测符合糖尿病大鼠模型标准，于第4 d进行创面造模。4组大鼠腹腔麻醉后，于腰椎正中偏上处备皮，剪去皮下组织至肌筋膜，制成大鼠全层皮肤缺损开放性创面(直径15 mm)模型。模型空白组、贝复济组和紫归长皮软膏组3组于创面造模当天、次日继续肌注氢化可的松琥珀酸钠。大鼠4只一笼饲养，自由进水饮食。

1.5 创面处理

正常空白组、模型空白组采用生理盐水纱布覆盖伤口，外用灭菌级干纱布包扎。紫归长皮软膏组采用紫归长皮软膏外敷。贝复济组采用贝复济喷伤口，灭菌级干纱布覆盖创面。4组创面均每天换药1次，分别于第7、10 d取创面组织标本。

1.6 观察指标

1.6.1 HE染色

取长约5 mm的创面肉芽组织，4%多聚甲醛固定，OTC包埋、切片(厚度12 μm)，HE染色，100倍光学显微镜下观察。

1.6.2 免疫组化

石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3×3 min；用pH 6.0的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液热诱导修复，室温自然冷却，PBS洗3×3 min；0.3%的H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min；PBS洗3×3 min；20%羊血清室温孵育30 min后滴加一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗3×3 min；EnVision试剂37 ℃孵育30 min；PBS洗3×3 min；DAB显色8～12 min；苏木素衬染，热水蓝化；吹干后，树脂封片；镜下观察，背景呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。测定图像中阳性区域面积和吸光度值，每张切片至少分析3个视野，计算出阳性区域面积百分比和吸光度值的乘积，计算3个视野的平均值为NGF表达水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色(图1)

正常空白组：第7 d创面有少量的单核细胞渗出，伴有成纤维细胞和毛细血管增生；第10 d皮下成纤维细胞生长较活跃，数量增多，毛细血管胚芽形成数量较少。

模型空白组：创伤后第7 d，有较多的单核细胞渗出，伴有成纤维细胞和极少毛细血管的增生；第10 d皮下成纤维细胞数量增多，毛细血管胚芽形成数量很少。

紫归长皮软膏组：创伤后第7 d，基本无单核细胞渗出，伴有大量成纤维细胞和毛细血管增生；第10 d皮下成纤维细胞生长活跃，数量多，毛细血管胚芽数量显著增多。

贝复济组：创伤后第7 d，基本无单核细胞渗出，伴有大量成纤维细胞和毛细血管增生；第10 d皮下成纤维细胞生长较活跃，数量多，毛细血管胚芽数量显著增多。

2.2 NGF免疫组化染色(图2、表1)

A：正常空白组造模第7天；B：正常空白组造模第10天；C：模型空白组造模第7天；D：模型空白组造模第10天；E：紫归长皮软膏组造模第7天；F：紫归长皮软膏组造模第10天；G：贝复济组造模第7天；H：贝复济组造模第10天A: At modeling day 7 of normal blank group; B: At modeling day 10 of normal blank group; C: At modeling day 7 of model blank group; D: At modeling day 10 of model blank group; E: At modeling day 7 of Zigui Changpi Paste group; F: At modeling day 10 of Zigui Changpi Paste group; G: At modeling day 7 of bFGF-torita group; H: At modeling day 10 of bFGF-torita group图2 各组大鼠创面肉芽组织NGF表达(×100)Fig.2 NGF expression of granulation tissue of rat wound in each group (×100)

表1 各组大鼠创面肉芽组织NGF表达

各组均有NGF表达，散见于整个切面，阳性染色多分布于纤维上，可见成纤维细胞染色及血管内皮细胞染色。

在创伤第7 d，正常空白组、紫归长皮软膏组及贝复济组的NGF表达明显优于模型空白组(P<0.05)；紫归长皮软膏组明显优于正常空白组和贝复济组(P<0.05)；贝复济组则优于正常空白组(P<0.05)。

在创伤第10 d，正常空白组与模型空白组NGF表达比较无统计学差异(P>0.05)，紫归长皮软膏组及贝复济组明显优于模型空白组和正常空白组(P<0.05)；紫归长皮软膏组明显优于贝复济组(P<0.05)。另外，创伤后第10 d时各组NGF表达较第7 d均有显著下降(P<0.05)。

3 讨论

难愈性创面可由多种原因引起[4]。目前，临床上各种抗感染的药物和敷料、凝胶[5-6]，以及促进愈合的生长因子制剂等，均使用非常广泛；此外，清创、VSD技术等也是临床较为有效的治疗手段[7-8]。中医中药治疗难愈性创面，遵循局部辩证，将难愈性创面分为脓腐期、生肌期、敛皮期，进行对症治疗。治疗药物多种多样，包括粉剂、丹剂、膏剂、中药溶液等，治疗手段包括蚕食清创、灌注冲洗、中药熏洗、艾灸熏治等[9]。我院的院内制剂紫归长皮膏以经临床研究证实，具有祛腐托腐、补血活血、生肌长肉的作用[10-13]，尤其适用于难愈性创面的治疗。本研究进一步针对组织形态学改变及NGF分泌情况，对紫归长皮软膏治疗难愈性创面进行观察，为临床应用提供理论依据。

创面组织中的神经生长因子不仅可以直接作用于创面组织，而且可以间接调控创面组织内源性释放各类生长因子及生长因子受体，起到正性调节作用，加速创面愈合，使创面愈合由以往的被动等待自愈发展为主动调控愈合[14-17]。

本研究结果显示，正常空白组及模型空白组于创伤后第7 d，均有单核细胞渗出，伴有成纤维细胞和毛细血管的增生，第10 d皮下成纤维细胞生长较活跃，数量多，其毛细血管胚芽形成数量仍较少；中药紫归长皮软膏组及贝复济组于创伤后第7 d，基本无单核细胞渗出，伴有大量成纤维细胞和毛细血管增生，第10 d皮下成纤维细胞生长活跃，数量多，毛细血管胚芽数量显著增多；紫归长皮软膏组优于贝复济组。通过免疫组织化学检测，进一步证实了NGF在各组、各时间点均有表达，表明其在创面愈合过程中均发挥作用。紫归长皮软膏在创伤后7 d及创伤后10 d均能明显促进NGF的表达，并优于贝复济及空白对照组。另外，各组NGF表达在创伤后10 d较创伤后7 d均有不同程度下降，这可能是因为创伤后10 d左右创面已接近愈合，伤口表面需要的神经营养因子逐渐减少。

综上所述，紫归长皮软膏能够促进大鼠难愈性创面组织内成纤维细胞和毛细血管增生，能够促进创面组织内NGF分泌，进而促进创面愈合。