4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因多样性分析和传播风险评估

刘 燕,朱 冬,2，何 燕，杨宇帆，彭 超，钱永明，王 东,唐 赟,路 璐*

(1.西华师范大学环境科学与工程学院,四川 南充 637009;2.中国科学院生态环境研究中心,北京 100085;3.西华师范大学生命科学学院,四川 南充 637002;4.西华师范大学法学院,四川 南充 637002)

我国是抗生素生产和使用大国，每年抗生素生产量约21万t，其中9.7万t(占年总产量的46.1%)抗生素用于畜禽养殖业。在畜禽养殖业中抗生素被应用于疾病预防和治疗，同时作为饲料添加剂促进动物生长。然而，长期滥用或不合理使用抗生素会诱导畜禽粪便中产生大量的抗生素耐药微生物和抗生素抗性基因。大量研究发现，畜禽粪便中含有高度富集的抗生素抗性基因，这些粪便会对养殖区域及周围环境造成潜在的抗性基因污染。同时，抗性基因的污染不同于传统的化学污染物，抗性基因可通过各种可移动遗传元件，如整合子、转座子或质粒等，通过转化、转导和接合等基因水平转移方式在同一菌种的个体之间甚至在不同菌种之间传递，并通过转化、转导和接合的途径进入其他环境细菌和致病菌中，对人类健康和生态环境造成潜在的威胁。

目前，我国对产生的大量畜禽粪便主要是通过肥料化技术进行资源化利用。虽然堆肥技术可以消减畜禽粪便中抗生素的残留、抗生素抗性基因的丰度以及致病微生物，但是一些研究发现堆肥后粪肥中仍有较高丰度的抗性基因存在，表示堆肥可能是良好的生物反应器，能促进其抗性微生物的增殖。此外，农田土壤中施用粪肥显著提高了抗生素抗性基因的丰度和多样性,可能导致耐药性微生物和抗性基因在农田生态系统中的扩散与传播。然而，除了批量地施用于农田土壤外，这些粪肥还可用于家庭种植花卉或者果蔬。目前随着网络交易平台的成熟，粪肥也大量在网络平台售卖，比如淘宝平台粪肥销售厂家约有700家，每天交易量达数百起。这种网络销售途径可能是抗生素抗性基因在更广范围上传播的新途径，进而导致被施用土壤中抗生素抗性基因的污染。此外，有研究表明肥料中的抗生素抗性基因能迁移至地上种植的植物或蔬菜根际、叶际中，进而可能通过食物链进入人体，对人类健康造成潜在的威胁。因此，探究网络销售的粪肥中抗生素抗性基因的多样性和丰度，并评估其潜在的传播风险显得尤为紧迫。

本研究以在网络平台购买的牛粪、羊粪、鸡粪和鸡羊混合粪4种粪肥作为供试材料，采用高通量荧光定量PCR技术对4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的丰度和多样性进行比较分析，评估网络交易的粪肥是否为抗生素抗性基因的传播途径，进而评价其传播风险。本文采用的296个引物涵盖了283个抗生素抗性基因(针对9种主要的抗生素：氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类、MLSB类、磺胺类、四环素类、万古霉素类、多重抗性类和其他类)、12个可移动遗传元件标记基因和细菌16S rRNA基因，以期对网络源粪肥中抗生素抗性基因污染情况有较全面的认识，并为可能的潜在生态环境风险评价提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试粪肥信息

于2018年10月8日在淘宝在线交易平台，分别在4个月销量大于1 300 kg的厂家购买了牛粪肥、鸡粪肥、羊粪肥和鸡羊混合肥4种发酵粪肥，发货地址分别是河南郑州、河南安阳、四川成都和安徽合肥。其中，鸡粪肥、羊粪肥、鸡羊混合粪肥是将其粪便经过堆肥发酵而形成的畜禽类粪肥；牛粪肥为蚯蚓堆肥，即使用发酵过的纯牛粪堆成垄状饲养蚯蚓，经蚯蚓消化后的肥料，再经过堆肥过筛再次发酵，形成松散的均匀粒状的牛粪肥。将各种粪肥过2 mm孔径筛并装入塑封袋中置于-20℃冰箱，以备后续分子生物学分析。

1.2 总DNA的提取

采用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals,Cleveland,OH,USA) 提取粪肥中的微生物总DNA，每个样品3个重复。样品中DNA浓度和质量采用NanoDrop分光光度计 (Nanodrop Technologies Inc.,Wilmington,DE) 进行测定和评估，所提取的DNA样品的A260/A280值在1.8～2.0之间，提取的DNA样品保存于-20℃以备后续分析。

1.3 荧光定量PCR分析

实时荧光定量PCR扩增使用SYBRPremix ExTaq TM(TliRNaseH Plus)试剂盒在CFX96 Optical Real-Time PCR System荧光定量仪(Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)上进行分析,对所有样品的16S rRNA基因丰度进行绝对定量。实时荧光定量PCR标准曲线采用含有16S rRNA基因的质粒，质粒标准曲线按10倍梯度稀释，得到7个数量级的标准曲线，其标准曲线质粒浓度的变化范围为10～10copies/μL。实时荧光定量PCR扩增体系为10 μL：5.0μL SYBRPremixEx Taq TM(TliRNaseH Plus)，1.0 μL DNA模板，10 μmol/L正、反向引物各0.1 μL，3.8 μL灭菌双蒸水，阴性对照采用灭菌双蒸水代替样品DNA，扩增效率为90.6%～101.3%，

R

在0.97～0.99的范围内。对4种粪肥的3个重复样品开展微生物总DNA的定量测定。

1.4 高通量荧光定量PCR测定抗生素抗性基因和可移动遗传元件

粪肥中的抗生素抗性基因在SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.,USA)高通量实时荧光定量PCR平台测定。抗性基因引物参照文献[5]，使用了283对抗性基因引物、8对转座酶基因、4对整合酶-整合子基因和1对细菌通用16S rRNA基因引物。高通量荧光定量PCR扩增体系的体积为100 nL，其中各试剂终浓度为：1×LightCycler 480 SYBRGreen IMaster Mix (Roche，USA),Nuclease-free PCR-Grade water，1 μg/μL的牛血清蛋白(BSA)，5 ng/μL的DNA模板和1 μmol/L的上下游引物。高通量荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，总共40个循环；热循环仪Cycler的程序自动升温进行熔解曲线分析。高通量荧光定量PCR每个芯片都有不添加DNA模板(用灭菌超纯水代替)的阴性对照。高通量荧光定量PCR反应得到的数据通过Cycler预设定的筛选条件(扩增效率介于1.8～2.2)进行导出。根据Smart Chip Real-Time PCR Systems的灵敏度和精确度，确定循环次数

C

值为31次时作为仪器的检测限，每个样品的2个重复均被检测出，且扩增效率在90%～110%内被视为有效数值。

1.5 统计分析

抗生素抗性基因和可移动遗传元件的相对拷贝数参照Zhu等的研究，采用公式(1)进行估算，并根据Stalder等的研究，采用公式(2)计算抗生素抗性基因的绝对丰度。具体计算公式如下：

C

=10[(31-)(103)]

(1)

基因的绝对拷贝数

(2)

式中:

C

为抗生素抗性基因的相对拷贝数(copies/bacterial cell)；

C

为PCR反应收集到特定荧光时的循环次数(次)；

A

为抗生素抗性基因的绝对丰度(copies/g)，16S rRNA基因的拷贝数(copies/g)。

本文利用Microsoft Excel 2016进行计算分析，使用SPSS 23.0(SPSS Inc.，USA)进行单因素方差显著性分析和相关性统计分析，利用 Origin Pro 2018(Origin Lab，USA)制图。

2 结果与讨论

2.1 4种网络交易的粪肥中检测出的抗生素抗性基因和可移动遗传元件的种类

4种网络交易的粪肥中检测出的抗生素抗性基因和可移动遗传元件的种类，见图1。

图1 4种网络交易的粪肥中检测出的抗生素抗性基因和可移动遗传元件的种类Fig.1 Diversity of antibiotic resistance genes and Mobile Genetic Elements(MGEs) in the four manure

由图1可以看出：

(1) 4种网络交易的粪肥中共检测出165种不同的抗生素抗性基因亚型，其中羊粪肥中检出的抗生素抗性基因最多，有130种，牛粪肥和鸡羊混合粪肥中检出的抗生素抗性基因最少，均为89种，鸡粪肥中检出98种抗生素抗性基因[见图1(a)]，这一发现与施用猪粪的水稻土壤(107种)、大型养猪场粪便(136种)、鸡粪肥(127种)和牛粪肥(107种)等环境中检出的抗生素抗性基因的个数相当，表明网络交易的粪肥中存在多样性丰富的抗生素抗性基因。4种网络交易的粪肥中共检出的可移动遗传元件的数量为10种，包括3个整合子和7个转座子，其中羊粪肥中检出的可移动遗传元件的个数最多，为8种[见图1(a)]。已有研究表明，抗生素抗性基因在环境中的水平基因转移与可移动遗传元件密切相关，抗生素抗性基因可以随着可移动元件(如整合子、质粒等)进行水平基因转移，使得抗性基因在不同种属微生物间传播，更是加剧了抗性基因在不同环境介质中的传播风险。可移动遗传元件作为基因水平转移重要的分子传播元件，在4种网络交易的粪肥中均被检出，表明在这4种粪肥中存在抗生素抗性基因水平转移的潜在风险。

(2) 4种网络交易的粪肥中检出的抗生素抗性基因主要以氨基糖苷类、大环内脂类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类(MLSB类)、多重耐药类和四环素类为主，分别占整体的比例为22%、21%、17%和14%[见图1(b)]，该发现与以往在牛粪肥、鸡粪肥和猪粪肥中检出的抗生素抗性基因的抗性类型相同。这可能与我国养殖业中使用的抗生素类型相关，因为抗生素的添加和残留是畜禽粪便抗生素抗性基因富集的主要原因之一，即使抗生素的浓度非常低，也能对环境中的抗性微生物和抗性基因产生选择性压力。且也有数据统计表明，我国养殖业饲料中主要添加隶属于氨基糖苷类的新霉素、庆大霉素，四环素类的土霉素、金霉素，林肯酰胺类的林可霉素，大环内酯类的泰乐菌素等抗生素。

(3) 4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的抗性类型组成存在一定的差异。在羊粪肥中检出的氨基糖苷类(30±0.71)、MLSB类(29±0.71)、多重耐药类(26±0.00)、四环素类(16±0.71)抗性基因的个数显著高于其他类粪肥(

p

<0.05)，而在牛粪肥中检出的氯霉素类(3±0.71)抗性基因的个数高于其他类粪肥，但4种粪肥中检出的β-内酰胺类、万古霉素类和其他类抗性基因的种类没有显著差别。4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因抗性类型的不同，可能是由于其粪肥对应的养殖场抗生素使用情况不同，且与堆肥的方式不同有关。宋婷婷等研究发现，堆肥方式的不同(温度、湿度、pH值、堆肥材料的性质、粪便的类型等)对粪肥中抗生素抗性基因的抗性类型有显著的影响。根据对抗生素抗性机制的不同，将检出的抗生素抗性基因分为抗生素失活、核糖体保护、外排泵作用和其他/未知4大类。4种网络交易的粪肥中抗生素主要的抗性机制为抗生素失活(43%)，其次为外排泵作用(31%)和核糖体保护(23%)，其他/未知仅为3%[见图1(c)]，这与Zhu等在3个大型养猪场猪粪及周边土壤的研究结果类似，其在猪粪中也发现抗生素失活和外排泵作用为主导的抗生素抗性机制。

2.2 4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的丰度分析

4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的绝对丰度和相对拷贝数，见图2。

由图2可以看出：

(1) 4种粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度介于7.18×10～3.99×10copies/g(干重)之间，且4种粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度间有显著差异(

p

<0.01)。其中，牛粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度最低，为7.18×10copies/g(干重)；羊粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度最高，为3.99×10copies/g(干重)，是牛粪肥的5 555.2倍；鸡羊混合粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度也显著高于牛粪肥和鸡粪肥，为2.66×10copies/g(干重)[见图2(a)]。羊粪肥和鸡羊混合粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度显著高于以往在农田土壤[10～10copies/g(干重)]、湖泊和水库[10～10copies/g(干重)]、河口底泥[10～10copies/g(干重)]等环境样品中所检测出的抗生素抗性基因的丰度，表明粪肥的网络交易可能导致抗生素抗性基因的高能扩散，其携带的抗性基因能通过施肥等方式扩散至不同的环境中。此外，该些网络交易的羊粪肥、鸡粪肥和鸡羊混合粪肥所检测出的抗生素抗性基因丰度也均高于Zhang等在鸡粪肥、牛粪肥和猪粪肥[10～10copies/g(干重)]中所检出的抗生素抗性基因的丰度，进一步揭示网络交易的粪肥存在抗生素抗性基因传播的风险，因此亟需制定网络交易粪肥抗性基因的控制标准。

图2 4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的绝对丰度和相对拷贝数Fig.2 Absolute abundance and relative abundance of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in the four types of manure

(2) 从各抗性基因类型的绝对丰度计算结果来看，4种网络交易的粪肥中主导的抗生素抗性基因类型是氨基糖苷类(47.10%)、磺胺类(22.04%)和多重耐药类(20.26%)，占总的绝对丰度的89.4%。这一结果与Zhang等对鸡粪肥、牛粪肥和猪粪肥中抗性基因类型丰度的研究结果相似，其也发现氨基糖苷类(20%)为丰度最高的抗性基因。而氨基糖苷类和磺胺类抗性基因的富集也可能与养殖业中这两类抗生素的广泛使用相关。多重耐药类抗性基因在4种网络交易的粪肥中的发现需要引起更多关注，已有研究表明多重耐药类抗性基因的传播对人类和动物抗感染治疗是极大的威胁。多重耐药类抗性基因的检出和较高丰度进一步表明需对网络交易的粪肥做微生物安全的防控。此外，不同类型的抗性基因绝对丰度在4种网络交易的粪肥中的比例也极显著不同(

p

<0.01)，如：鸡羊混合粪肥中氨基糖苷类抗性基因的绝对丰度显著高于其他3种粪肥(

p

<0.05)，其绝对丰度分别是牛粪肥、鸡粪肥和羊粪肥的10 266.1倍、110.7倍和1.2倍；磺胺类抗性基因的绝对丰度在羊粪肥中最高，是牛粪肥、鸡粪肥和羊粪肥的13 354.23倍、6.87倍和1.62倍。不同粪肥中抗生素抗性基因绝对丰度的差异可能与不同养殖场抗生素使用类型、用量以及后续发酵处理的差异等因素相关。如Zhu等在分析比较北京、嘉兴和莆田3个养猪场粪肥中抗生素抗性基因的绝对丰度时也发现，3个养殖场粪肥中抗生素抗性基因的种类和丰度组成不同，该结果说明不同网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的承载量以及类型、丰度有显著的差异。

(3) 为评估抗生素抗性基因在整个细菌群落中的丰度及其富集程度，本文计算了4种网络交易的粪肥中平均每个细菌细胞中抗生素抗性基因的相对拷贝数[见图2(b)]，相对拷贝数越高，表明该样品中抗性基因的富集密度和传播风险越大。4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数范围在0.013～0.727 copies/bacterial cell之间，平均每个细胞有0.253个抗性基因。4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数变化规律与抗生素抗性基因绝对丰度的变化规律一致，羊粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数仍是最高，为0.727 copies/bacterial cell，牛粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数最低，为0.013 copies/bacterial cell,仅是羊粪肥的1/56。4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数介于前期研究的堆肥污泥(0.77～2.50 copies/bacterial cell)、河口底泥(0.21～1.93 copies/bacterial cell)以及鸡粪肥、牛粪肥和猪粪(0.15～1.81 copies/bacterial cell)等环境样品中抗生素抗性基因的相对拷贝数检测值。而这4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因的相对拷贝数均显著高于何燕等在7个稻田土壤粪肥中抗生素抗性基因的检测范围(0.006～0.025 copies/bacterial cell)，同时也高于其他农田土壤(平均值为0.074 copies/bacterial cell)、淡水湖泊(0.01～0.38 copies/bacterial cell)等环境样品中抗生素抗性基因在微生物群落中的富集程度。这些结果表明网络交易的粪肥中存在抗生素抗性基因的富集，具有较高的传播风险。

(4) 从各类型抗性基因的相对拷贝数计算结果来看，4种网络交易的粪肥中的抗生素抗性基因种类以氨基糖苷类(39.91%)、磺胺类(24.71%)和多重耐药类(22.60%)3类为主导。4种网络交易的粪肥中不同抗生素抗性基因的相对拷贝数也有显著的差异(

p

<0.01)。如在牛粪肥、羊粪肥和鸡羊混合粪肥3种粪肥中，主导的抗生素抗性基因为氨基糖苷类，占总抗性基因相对拷贝数的23.64%～65.57%，其次是多重耐药类，占总抗性基因相对拷贝数的9.55%～28.11%。然而，鸡粪肥中主导的抗性基因为磺胺类(72.35%)，其次才是氨基糖苷类(9.17%)，两者占总抗性基因相对拷贝数的81.54%。值得注意的是，在4种网络交易的粪肥中，牛粪肥中抗生素抗性基因的种类和丰度均极显著低于其他粪肥(

p

<0.01)，且显著低于以往在牛粪肥等粪肥中检出的抗生素抗性基因种类和丰度。本研究中的牛粪肥经过了蚯蚓进一步分解，其中的有机质进一步得到分解。有研究表明，在长期施用污泥或鸡粪肥的土壤中发现，土壤动物蚯蚓肠道中的抗生素抗性基因丰度显著增加。而本研究中网络购买的牛粪肥蚯蚓堆肥中较低的抗生素抗性基因丰度可能受很多未知因素的影响，其抗生素抗性基因丰度是否与抗性基因向蚯蚓肠道中迁移有关、抑或蚯蚓降低了粪肥中抗性基因的丰度，或是否由于抗性基因本身在粪源中含量较低，仍需要未来进一步设计试验来进行研究验证。该结果也进一步表明网络交易的不同粪肥中含有的抗生素抗性基因的丰度有较大的差异。

2.3 4种网络交易的粪肥中可移动遗传元件丰度比较及其相对拷贝数与抗生素抗性基因相对拷贝数的相关性分析

由图2(c)、(d)可见，4种网络交易的粪肥中可移动遗传元件(转座子和整合子)的绝对丰度和相对拷贝数分别介于2.61×10～2.90×10copies/g(干重)和0.007～0.088 copies/bacterial cell之间，并且不同的粪肥其绝对丰度和相对拷贝数均有显著性的差异(

p

<0.05)。4种网络交易的粪肥中可移动遗传元件的绝对丰度显著高于河口底泥[5.66×10～4.23×10copies/g(干重)]，与稻田土壤的可移动遗传元件绝对丰度[1.14×10～2.29×10copies/g(干重)]相当。本研究中的粪肥样品中可移动遗传元件的相对丰度显著高于森林土壤，且其每克粪肥样品中可移动遗传元件的绝对丰度比受人为干扰极少的北极圈土壤高出10～10copies/g(干重)。羊粪肥中可移动遗传元件的绝对丰度和相对拷贝数均显著高于其他粪肥样品，分别高出其他3种粪肥约4～1 110倍和6～12倍。可移动遗传元件作为基因水平转移的重要传播元件，表明羊粪肥中抗性基因可能有较高的传播风险。4种网络交易的粪肥中各抗性基因相对拷贝数与可移动遗传元件相对拷贝数的相关性分析结果，见表1。

表1 4种网络交易的粪肥中各抗生素抗性基因相对拷贝数与可移动遗传元件相对拷贝数的相关性分析Table 1 Pearson correlation for the relative copy mumber of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in the four online-trading manure

通过分析4种网络交易的粪肥中各抗性基因相对拷贝数与可移动遗传元件相对拷贝数的相关性(见表1)，结果表明：4种网络交易的粪肥中总抗性基因相对拷贝数与总可移动遗传元件的相对拷贝数呈极显著正相关(

p

<0.01)，这一结果与在水体、鸡粪、牛粪和猪粪、施肥后的土壤等不同环境样品中的研究结果相同，表明抗生素抗性基因可通过可移动遗传元件进行基因的水平转移，使得抗生素抗性基因在不同微生物间迁移传播，进而增加其传播风险，说明这些粪肥中抗生素抗性基因的水平转移可能是抗性基因迁移传播的重要途径。本研究还发现，多重抗药类抗性基因、四环素类抗性基因、氯霉素类抗性基因、MLSB类抗生素抗性基因的相对拷贝数与可移动遗传元件的相对拷贝数都呈极显著正相关(

p

<0.01)，这一结果与dela Cruz等的研究结果相似，其发现四环素类和氯霉素类抗性基因相对拷贝数与可移动遗传元件相对拷贝数具有一定的相关性，进一步表明这4种粪肥中可移动遗传元件可能促进了这些抗生素抗性基因的迁移、传播和扩散。此外，所有的抗生素抗性基因类型都与整合子有显著的相关性(

p

<0.05)。整合子被认为是导致耐药基因在细菌间水平转移的重要原因之一，表明抗性基因的水平转移可能在粪肥中抗生素抗性基因的富集中起着关键的作用，并可能加剧粪肥中抗性基因传播的风险。然后，这些粪肥在施入土壤后，其中的抗生素抗性基因在土壤中的归趋行为、或传播至地上植物的迁移行为等，仍需要进一步开展模拟试验研究来直接揭示抗性基因的传播行为模式和风险。

2.4 4种网络交易的粪肥中共有、独有和主导的抗生素抗性基因种类分析

4种网络交易的粪肥中共有、独有和主导的抗生素抗性基因种类分析结果，见图3和图4。

图3 4种网络交易的粪肥中检出的抗生素抗性基因和可移动遗传元件种类数的韦恩图Fig.3 Venn based on the number of antibiotic tresisance genes and mobile genetic elements detected in the four online-trading manure

图4 4种网络交易的粪肥中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的相对丰度热图Fig.4 Heat map based on the relative abundance of antibiotic resistance genes and mobile genetic elementsin the four online-trading manure

由图3和图4可见，4种粪肥中共有的抗生素抗性基因亚型有35种，可移动遗传元件有4种。4种网络交易的粪肥中共有的主导抗性基因亚型和可移动遗传元件为

sul

2(磺胺类)，

aadA

-02、

aadA

2-03、

aadA

-01、

aadA

1和

aadA

2-02(氨基糖胺类)，

tetL

-02(四环素类)，

intI

-1

LC

(整合子类)。其中，

sul

2抗性基因在牛粪肥、鸡粪肥、羊粪肥和鸡羊混合粪肥中分别占总抗性基因相对拷贝数的4.49%、58.26%、18.67%和18.56%，

sul

2抗性基因已在河流沉积物、土壤、养猪场猪粪及其周边土壤等环境样品中检出并且丰度较高，这可能是由于

sul

2抗性基因通常定位于较小的非接合型质粒或较大的可移动多重抗性质粒上，而质粒作为可移动元件是抗生素抗性基因水平基因转移的重要途径，可能导致了

sul

2抗性基因在各环境条件下的广泛分布；

aadA

类基因在牛粪肥、鸡粪肥、羊粪肥和鸡羊混合粪肥中占总抗性基因相对拷贝数的5.30%、5.36%、31.81%和61.97%，

aadA

类抗性基因是在污水、废水和动物粪便等环境样品中检出最为频繁的一类基因，且

aadA

类抗性基因通常存在于整合子类

intI

-1的基因盒中，

aadA

类抗性基因在4种网络交易的粪肥中均被检出进一步表明粪肥中抗性基因存在很高的水平基因迁移风险；编码外排泵类四环素抗性基因

tetL

-02在4种网络交易的粪肥中均被检出，并且有较高的丰度，

tetL

-02抗性基因在猪粪、土壤、废水等环境样品中均被检出，此外有研究发现，

tetL

-02抗性基因与转座子

tnpA

抗性基因呈显著正相关，而转座子作为可移动遗传元件可促进基因水平转移，进而增加其潜在的传播风险；

intI

-1

LC

抗性基因是对抗生素抗性基因水平迁移有关键作用的整合子基因，

intI

-1

LC

类整合子是判定环境是否受人为源污染的标志基因之一，此外

intI

-1

LC

抗性基因可与很多抗生素抗性基因的基因盒进行整合连接，如氨基糖苷类抗性基因

aadA

、四环素类抗性基因

tetG

等都在

intI

-1类整合子的基因盒中发现，从而使细菌产生多重耐药性。此外，不同粪肥中的主导抗性基因也各不相同(见图4)。如牛粪肥中主导的抗性基因亚型为

aacC

(氨基糖胺类)、

mphA

-01(

MLSB

类)、

sul

2(磺胺类)和

oprD

(多重耐药类)，占总抗性基因相对丰度的45.19%；而羊粪肥主导的抗性基因亚型则为

sul

2(磺胺类)、

qacEdelta

1-02和

mexF

(多重耐药类)、

aadA

9-02、

aadA

9-01和

aadA

2-01(氨基糖胺类)，占总抗性基因相对丰度的58.15%。4种网络交易的粪肥中均检出其独有的抗生素抗性基因(见图3)。如羊粪肥中检出24种其独有的抗性基因，其中多重耐药类

mexF

抗性基因的相对丰度最高，占总抗性基因相对丰度的28.12%。有研究发现

mexF

抗性基因在施用了粪肥的土壤中显著富集；黄福义等也研究发现施用了猪粪的水稻土壤中

mexF

基因的相对丰度相对于对照组土壤增加了1 791倍。牛粪肥中检出10种独有的抗性基因，其中万古霉素类

vanC

-03抗性基因占总万古霉素类抗性基因相对丰度的70.41%。万古霉素作为人类抵抗细菌感染的“最后一道防线”之一，然而，随着人类医疗中万古霉素的广泛使用，已在很多环境中富集，如河口沉积物、土壤、水体，万古霉素类抗性基因的检出和富集表明牛粪肥可能受到人为污染源的影响，并警示粪肥中抗性基因的污染亟需管控。此外，

qacEdelta

1-02抗性基因仅在羊粪肥和鸡羊混合粪肥中检出，且分别占两者总抗性基因相对丰度的68.11%和22.76%，且该抗性基因与可移动遗传元件呈显著正相关(

R

=0

.

993，

p

<0.01)。

qacEdelta

1抗性基因一般存在于Ⅰ类整合子的3′保守区，该抗性基因在粪肥中的富集表明这些粪肥施用至土壤环境中会存在潜在的水平基因转移。

3 结论与建议

(1) 4种网络交易的粪肥中存在丰富多样的抗生素抗性基因，粪肥的网络交易可能是抗生素抗性基因潜在的迁移和传播载体。

(2) 购买于不同商家的4种粪肥中抗生素抗性基因的丰度均有显著的差异(

p

<0.01)，且其主导的抗性基因类型以及亚基型组成均存在差异，这可能与生产粪肥的养殖场类型、抗生素使用类型以及发酵技术相关。更大尺度和广度的网络源粪肥中抗性基因的分布规律仍需进一步探究。(3) 4种网络交易的粪肥中均检测出较高丰度的可移动遗传元件，且抗生素抗性基因相对拷贝数与可移动遗传元件的相对拷贝数呈极显著正相关(

p

<0.01)，表明粪肥中的抗生素抗性基因存在转移的风险，因此需加强对粪肥抗生素抗性基因水平转移的风险评估，并建议国家相关农业部门加强粪肥的监查管理，制定网络交易粪肥的微生物安全标准，并完善相关法律管控。