草甘膦对小球藻生长和氮磷去除的毒物兴奋效应*

周琼芝， 郑伟东， 贺 众， 张 楠

(湘潭大学 环境与资源学院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

近年来，随着工农业及养殖业的规模化和高速发展，农药和农用化肥(如氮肥、磷肥等)的施用量迅速增加，严重污染了人类生活环境，我国约有1 600万公顷农业土地受到污染[1-2]，国内河流中已经有70.6%被农药污染[3].同时，氮、磷等植物生长必需的营养物质随各种废水进入到江河、湖泊、海洋等自然水体中，造成严重的水体富营养化，致使藻类等水生植物大量繁殖[4]，从而导致水生态系统物种分布失衡.

草甘膦作为一种广谱性有机磷除草剂，具有高效、低毒、低残留、能提高农作物产品质量等特点，被广泛应用于农林业生产和日常生活中[5-6].但暴露在环境中的草甘膦可通过多种途径进入水体并造成水体污染，会对人体健康和水生生物产生潜在毒性[7].藻类作为水生生态系统最主要的初级生产者，在维持水生生态系统平衡和稳定方面十分重要[8].藻类对有机磷农药非常敏感，且具有生长周期短、繁殖迅速的特点，因此可以成为一种良好的毒物风险测试生物.在某些特定条件下，藻类会在短时间内爆发性增殖或高度聚集，导致其他生物死亡，从而增加引发水华、赤潮的风险[9].在一定的范围里低浓度的有机磷农药可能会对藻类的生长产生刺激兴奋作用.低浓度下的乐果农药会增加小球藻的生物量、细胞内的叶绿素和蛋白质含量以及碱性磷酸酶活性，促进小球藻的生长[10].Belz[11]的研究表明除草剂能增强植物光合作用，从而提高植物对除草剂的适应性，刺激植物的生长.

本论文以小球藻为受试生物，旨在探讨有机磷农药草甘膦对小球藻生长和氮磷去除的毒性兴奋效应，为草甘膦的合理安全使用提供理论依据，以更好地认识农药对生态系统结构和功能的整体效应.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与试剂

普通小球藻(FACHB-1068)购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库.纳氏试剂、酒石酸钾钠、钼酸铵、抗坏血酸、小球藻OECD营养盐、草甘膦、二甲基亚砜、蒽铜、考马斯亮蓝、醋酸钠、对硝基苯磷酸二钠均为分析纯.实验用水均为超纯水.

1.2 实验方法

1.2.1 叶绿素含量的测定小球藻经过草甘膦处理，取10 mL藻液离心(4 000 r/min,10 min)，弃上清液，加二甲基亚砜3.33 mL，65 ℃水浴20 h；然后离心，将上清液转移到10 mL棕色瓶(避光防止色素分解)中，添加6.67 mL 80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清液转移到10 mL棕色瓶中定容.取上清液用于可见分光光度计测定吸光值(波长645 nm和663 nm)[12]叶绿素a、b和叶绿素总含量的计算公式分别如下：

ρChla= 12.70A663- 2.69A645，

(1)

ρChlb= 22.9A645- 4.64A663，

(2)

ρChl= 20.2A645+ 8.02A663.

(3)

式中：ρChla和ρChlb分别为叶绿素a和b的浓度;ρChl为叶绿素总浓度;A645和A663分别为叶绿体色素提取液在波长645 nm和663 nm下的吸光值.

1.2.2 蛋白质和可溶性多糖的测定硫酸-蒽铜法：取0.5 mL的待测液放入试管中，加超纯水0.5 mL，按顺序向试管内加入5 mL硫酸蒽铜试剂，振荡摇匀，于沸水浴中反应10 min，置冷水中冷却.用分光光度计测量620 nm波长下的吸光度.

考马斯亮蓝法：取1 mL的待测液放入试管中，加入5 mL考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2 min后于595 nm波长下测定吸光度.

1.2.3 氮磷吸收关键酶(GS、ACP)活性的测定采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒测定谷氨酰胺合成酶活性：提取液体积按5 000∶1～1 000∶1的比例取5 mL，超声破碎细胞(冰浴，功率60%或600 W，超声2 s，间隔3 s，持续10 min)；8 000 g在4 ℃条件下离心10 min，取上清液，置冰上待测；测定540 nm下的吸光值.

采用分光光度法测量酸性磷酸酶活性：取草甘膦处理后的样品100 mL，4 000 r/min离心10 min，留下藻泥，加入0.2 mol/L的醋酸钠缓冲液(pH 5.8)8 mL超声破碎，随后12 000 r/min离心15 min，静置.取上清液1 mL，加入0.05 mol/L的对硝基苯磷酸二钠(醋酸钠缓冲液配置)2 mL，加盖摇匀，37 ℃水浴30 min. 水浴后分别加入终止液CaCl22 mL浓度为0.5 mol/L和NaOH 2 mL 浓度为2 mol/L以终止反应，摇匀.2 500 r/min离心5 min，4 000 r/min再离心5 min.取上清液测量410 nm处的吸光值[13].

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的测定采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行测定：提取液体积按5 000∶1～1 000∶1的比例取5 mL，超声破碎细胞(冰浴，功率60%或600 W，超声2 s，间隔3 s，持续10 min)；8 000 g在4 ℃条件下离心10 min，取上清液，置冰上待测；SOD测定560 nm下的吸光值，CAT测定240 nm下的吸光值.

1.2.5 细胞膜通透性测定细胞内的非特异性酯酶能够水解FDA，产生荧光，通过测定FDA的水解速率来反应细胞膜的通透性[14].取藻液离心，用PBS洗涤两遍，于分光光度计680 nm下调节吸光值为0.110 Abs(藻密度约为1.0×106cells/mL)[15].测定时加入FDA溶液，使其最终浓度为1.0×10-6mol/L.使用荧光分光光度计的时间模式扫描加入FDA后前10 min的水解速率(线性方程的斜率).激发波长480 nm，发射波长530 nm，电压700 V，狭缝宽度：5 nm.所测相关系数(R2)均在0.98以上.为了更好地观察草甘膦对细胞膜通透性的影响，换算成相对细胞膜通透性.

2 实验结果与讨论

2.1 草甘膦对小球藻细胞生物量的影响

草甘膦对小球藻生物量的影响如图1所示，当草甘膦浓度分别为 0.25 mg/L和0.50 mg/L 时，小球藻生长第7天的藻密度分别为10.44×106cells/mL和10.66×106cells/mL.与对照组相比，0.25 mg/L和0.50 mg/L的草甘膦浓度促进了小球藻生长，增长率分别为0.28%和2.50%，而当加入草甘膦的浓度为 1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L时，小球藻生长第7天的藻密度分别为10.03×106cells/mL、9.78×106cells/mL、9.27×106cells/mL、7.78×106cells/mL、4.36×106cells/mL，小球藻的生长受到抑制，抑制率分别为3.56%、5.96%、10.87%、25.19%、58.08%.由以上结果分析可得，低浓度草甘膦能促进藻类生长.

图1 草甘膦对小球藻生物量的影响Fig.1 The effect of glyphosate on the biomass of Chlorella vulgaris

沈宏等[16]研究表明，草甘膦对小球藻的毒害和藻类降解草甘膦这两个过程同时存在，在浓度较低时降解过程占主导地位，而降解产物可作为藻类生长的营养源，从而促进藻细胞DNA、RNA和蛋白质合成的增加，因此有机磷农药对藻类的生长表现为低浓度的刺激效应和高浓度的抑制作用.

2.2 草甘膦对小球藻氮磷去除效率的影响

图2 草甘膦对小球藻氨氮去除率的影响Fig.2 Removal efficiency of mg/L) by Chlorella vulgaris under glyphosate

图3 草甘膦对小球藻正磷酸盐去除率的影响Fig.3 Removal efficiency of PO43+ mg/L) by Chlorella vulgaris under glyphosate

2.3 草甘膦对小球藻叶绿素、可溶性多糖和蛋白质的影响

表1所示为草甘膦在不同浓度下，小球藻在实验周期第7天的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量.从表1可以看出，叶绿素含量均随着草甘膦浓度的增加呈现先升后降的趋势，在低浓度范围内(0～0.5 mg/L)提高了小球藻的叶绿素含量，且在0.5 mg/L时叶绿素含量出现最大值，其中叶绿素a含量为16.31 mg/L，叶绿素b含量为7.05 mg/L，总叶绿素含量为22.90 mg/L，叶绿素a、b含量比值为2.31.以上结果表明：当草甘膦浓度低于某一阈值时，能促进藻细胞内叶绿素的合成；高浓度草甘膦(1～45 mg/L)，叶绿素含量均低于对照组，说明高浓度草甘膦抑制了藻细胞内叶绿素的合成.研究报道，叶绿素含量的高低能反映细胞的生长情况，当五氯苯酚的浓度低于0.99 μg/L时提高了小球藻和铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)叶绿素a的含量，由于藻细胞自身通过调节体内平衡抵消了低浓度的五氯苯酚对藻细胞的毒性效应，从而促进了微藻的生长，表现为刺激作用.当五氯苯酚的浓度高于1.02 μg/L时，叶绿素a含量下降，藻细胞自身不足以抵消毒物带来的毒性作用，从而抑制了小球藻和铜绿微囊藻的生长[17].

表1 草甘膦对小球藻叶绿素含量的影响

图4表示在不同浓度草甘膦下，小球藻内可溶性多糖和蛋白质的变化.由图4可知，当草甘膦浓度为0.25 mg/L、0.5 mg/L时，小球藻内可溶性多糖和蛋白质的合成量均高于空白组，在0.5 mg/L时可溶性多糖和蛋白质的含量达到最大值，分别为69.83 mg/L和442.08 mg/L；而草甘膦浓度在1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L时，其合成能力受到抑制，草甘膦浓度为45 mg/L时，可溶性多糖和蛋白质含量分别比对照组低29.30%和53.48%.与本文研究结果相似，Liu等[18]研究表明，低浓度阿莫西林(0～500 ng/L)诱导铜绿微囊藻蛋白质和可溶性多糖的含量增加，分别高于对照组31.81%和43.75%.在低浓度有机磷农药(<1 mg/L)作用下，肋骨条藻和赤潮异弯藻内蛋白质的含量分别比对照组提高了28%和17%，而当有机磷农药浓度高于100 mg/L时，两种海洋微藻内蛋白质含量仅为对照组的10%和39%[2].

图4 草甘膦对小球藻胞内可溶性多糖和蛋白质含量的变化Fig.4 Change of intracellular protein and polysaccharides from Chlorella vulgaris under the stress of glyphosate

2.4 草甘膦对小球藻GS和ACP酶活性的影响

小球藻对水体中的氮磷元素的消耗需要酶的调控.藻细胞主动运输并吸收水体环境中的氨氮，同化为自身的大分子物质如蛋白质等，而蛋白质的合成则需要通过谷氨酸代谢途径完成，在其中谷氨酰胺合成酶起重要作用[19]；磷通常以正磷酸盐的形式被藻类或者植物吸收，酸性磷酸酶可以催化磷酸单脂的水解及释放无机磷，密切参与磷的代谢活动[20].

草甘膦对小球藻谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性的影响如图5所示.与对照组相比，当草甘膦浓度低于0.50 mg/L时，小球藻的谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性均高于对照组，与草甘膦对小球藻氮磷去除率的影响一致，谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性在草甘膦浓度为0.5 mg/L时出现最大值，分别比对照组(266.81 U/g和783.56 U/g)高26.67%和9.08%.而当加入草甘膦的浓度≥1 mg/L时，小球藻氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶活性明显低于对照组，在45 mg/L时仅为(101.79 U/g和480.97 U/g).以上实验结果说明：低浓度的草甘膦(<0.5 mg/L)提高了小球藻细胞内谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶的活性，从而提高了小球藻对氮磷的去除效率并促进了生化组分的合成，表现为刺激作用；而高浓度的草甘膦(≥1 mg/L)使得谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶的活性降低，从而降低了小球藻对氮磷的去除效率并阻碍了生化组分的合成，表现为明显的毒性作用.

图5 草甘膦对小球藻谷氨酰胺酶和酸性磷酸酶活性的影响Fig.5 Effect of CTAB on the GS and ACP activity of Chlorella vulgaris

2.5 草甘膦对小球藻超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性的影响

草甘膦在不同浓度的情况下对小球藻超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性的影响如图6所示.当草甘膦浓度分别为0.25 mg/L、0.50 mg/L时，小球藻的超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性高于对照组(1 421.06 U/g和810.47 U/g)，在0.50 mg/L时达到最大值，分别为2 190.07 U/g和1 207.77 U/g.而当加入草甘膦的浓度为1 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、45 mg/L时，小球藻的超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性受到抑制.以上结果表明，低浓度草甘膦对小球藻超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性均有刺激作用，反映为小球藻受草甘膦氧化胁迫，机体抗氧化能力增强，当草甘膦浓度≥1 mg/L时，随着草甘膦浓度增加超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性逐渐下降，细胞的氧化损伤增强.晁华等[21]研究表明，许多农药能够抑制生物体内抗氧化酶的活性，导致生物体内活性氧自由基含量的增加，对生物体构成氧化胁迫，由超氧化歧化酶、过氧化氢酶等组成的抗氧化系统能够有效防御活性氧自由基的侵害，其活性变化可以作为微藻抵御污染物致毒胁迫能力的生物标志物.黄健等[22]认为污染物在低浓度范围内，藻细胞内的自由基含量在一定范围内升高，生理生化代谢和繁殖的能力得以增强，表现为藻细胞生长的毒物兴奋效应.

图6 草甘膦对小球藻超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性的影响Fig.6 The influence of glyphosate on activity of SOD and CAT in Chlorella vulgaris

2.6 草甘膦对小球藻细胞膜通透性的影响

营养物质首先通过细胞膜进入细胞内，再被吸收利用转化为生物骨架.因此，细胞膜的性质决定了营养物质的运输效果.草甘膦对小球藻细胞膜通透性的影响如图7所示，随着草甘膦浓度上升，细胞膜的通透性在一定范围内增加.当草甘膦浓度达到最高浓度(45 mg/L)时，细胞膜相对通透性均是对照组的2.51倍.

图7 草甘膦对小球藻细胞膜相对通透性的影响Fig.7 Effect on membrane permeability of Chlorella vulgaris under the stress of glyphosate

当草甘膦浓度比较低(≤0.50 mg/L)时，细胞膜通透性增强，草甘膦能够加快氮磷等营养物质进入小球藻细胞膜的速度，提高细胞内的转化效率[22].当草甘膦浓度超过1 mg/L时，细胞膜通透性进一步增加，细胞膜被破坏，胞内物质外流，有毒物质进入并毒害细胞，随着藻体内有毒物质不断堆积，小球藻细胞活性受到危害，胞内小球藻对氮磷的吸收受阻，从而抑制藻细胞生长.

3 实验结论

草甘膦浓度为0～0.5 mg/L时，促进了小球藻生物量和主要生化组分的合成，提高了小球藻对氮磷的去除效率和氮磷关键酶(谷氨酰胺合成酶和酸性磷酸酶)、超氧化歧化酶和过氧化氢酶活性，从而促进小球藻的生长；而草甘膦浓度≥ 1 mg/L时抑制小球藻的生长、氮磷去除率和细胞活性，表现为毒物兴奋效应即低浓度的刺激作用和高浓度的抑制作用.细胞膜的通透性随着草甘膦浓度增加而增大，在低浓度范围内，细胞膜通透性的小幅度增加有益于营养物质的吸收，而当草甘膦浓度超过1 mg/L，细胞膜通透性大幅度增加，细胞膜受到损伤，有毒物质进入细胞，损害细胞的生长繁殖.