miR-9-5p 通过靶向UBE4B 调节缺氧诱导转录因子1α 泛素化介导瓦博格效应在胶质瘤细胞中的应用

张晶晶 努尔艾合麦提江·牙力昆 杜 鹏

新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆乌鲁木齐 830063

与体细胞代谢比较，肿瘤细胞多采用有氧糖酵解的形式进行代谢，这种代谢表型称为瓦博格效应[1-2]。在多种肿瘤中观察到酵解酶[包括葡萄糖转运蛋白同工型1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（human hexokinase-2，HK2）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase，LDHA）]的表达活性升高[2]。缺氧诱导转录因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）是一种细胞适应氧应激的关键介质[3]。HIF1α 通过在其启动子区域与HIF1α 反应元件（hypoxia response element，HRE）结合来增强糖酵解基因的表达[3]。HIF1α 的表达受到包括泛素化途径在内的多种方式影响[4]。UBE4B作为一种重要的泛素化E3 连接酶已被证明可调节癌细胞的代谢重编程并促进肿瘤生长[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）通过与信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’-非翻译区（3’untranslated region，3’-UTR）结合从而调控相关基因表达[6]。miR-9-5p 已显示在包括乳腺癌、肺癌和胃癌的发展中起关键作用[7-9]。因此，本研究旨在探索miR-9-5p 在肿瘤发生中的作用，并深入探讨UBE4B/HIF1α 在miR-9-5p 调控胶质瘤及瓦博格效应中的作用机制，为胶质瘤的治疗思路提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本、细胞及动物

2018 年5 月至2020 年10 月收集30 例来自新疆医科大学第二附属医院（以下简称“我院”）确诊患者的神经胶质瘤及癌旁组织。研究设计得到我院医学伦理委员会的批准。胶质瘤细胞（U251 细胞）购自中国科学院典型培养物保藏中心（中国上海）。将细胞置于含血清及双抗的DMEM 培养基（美国Gibco，生产批号：0030034DJ）及5%的CO2和37°C 中培养。22 只5 周龄的雄性BALB/c 裸鼠购自上海实验动物公司[许可证：SCXK（沪）2017-0006；质量合格证号：60304257]。

1.2 RNA 提取和实时定量PCR

根据制造商的说明，使用miRcute miRNA 试剂盒（中国天根，货号：DP501）从组织或细胞中提取miRNA。使用miScript SYBR Green PCR Kit（天根，生产批号：FP411-02）测定miR-9-5p 的表达水平。使用Applied Biosystems 7300 实时PCR 系统进行定量实时PCR，内参基因分别为GAPDH 和U6。

1.3 蛋白质印迹

使用蛋白提取试剂盒提取蛋白质，然后使用BCA蛋白测定试剂盒（中国碧云天，货号：P0012S）对样品的蛋白质浓度进行标准化。封闭后，用抗UBE4B 抗体（美国Abcam，生产批号：ab126759），HIF1α（美国Abcam，生产批号：ab270520）和β-actin（美国Abcam，生产批号：ab6276），然后是辣根过氧化物酶结合的二抗（美国Abcam，生产批号：ab151752）。通过化学发光法进行检测。

1.4 葡萄糖摄取分析

将U251 细胞用磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，然后在含有葡萄糖的DMEM 中孵育3 h。用冰冷的PBS 洗涤细胞，并溶解在1%的SDS中。使用闪烁计数器（美国Beckman LS 6500，CA）确定每个等分试样的放射性。重复6 次。

1.5 乳酸产量测量

按照制造商的说明方法，使用乳酸检测试剂盒（中国碧云天，生产批号：P0012S）对U251 细胞乳酸的产生进行定量。使用CellTiter-Glo®发光细胞活力测定试剂盒（中国泽浩生物，货号：G7570）测量ATP水平。重复6 次。

1.6 细胞活力和增殖分析

通过MTT 法来确定细胞活力。同时使用细胞增殖酶联免疫吸附试验（BrdU 试剂盒）（中国艾美杰，货号：K306-200）来分析DNA 合成过程中生成的BrdU来检测细胞增殖情况。重复6 次。

1.7 动物实验

将稳定表达miR-9-5p 模拟物和对照组的5.0×106U251 细胞皮下注射到裸鼠前腿下方的皮肤上。在16 d 内观察小鼠的肿瘤形成。然后处死小鼠，并确定每个肿瘤的湿重和体积。并按照“1.3”中方法对UBE4B、HIF1α 蛋白以及Glut1、HK2 和LDHA mRNA水平进行检测。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。计数资料以例数或百分比表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-9-5p 对HIF1α 及糖酵解的影响

miR-9-5p 过表达组HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF mRNA 表达显著高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。miR-9-5p 抑制剂组HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF 表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表1 miR-9-5p 过表达对HIF1α 和糖酵解酶的表达的影响（）

表1 miR-9-5p 过表达对HIF1α 和糖酵解酶的表达的影响（）

注：HIF1α：缺氧诱导转录因子1α；Glut1：葡萄糖转运蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脱氢酶A；VEGF：血管内皮生长因子

表2 抑制miR-9-5p 对HIF1α 和糖酵解酶的表达的影响（）

表2 抑制miR-9-5p 对HIF1α 和糖酵解酶的表达的影响（）

注：HIF1α：缺氧诱导转录因子1α；Glut1：葡萄糖转运蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脱氢酶A；VEGF：血管内皮生长因子

2.2 miR-9-5p 调节神经胶质瘤细胞中的葡萄糖代谢

与对照组比较，miR-9-5p 过表达组显著增强了代谢及转移（P ＜0.05），而miR-9-5p 抑制剂组显著降低了U251 细胞中的葡萄糖摄取和乳酸生成（P <0.05）。见图1A～D。

图1 miR-9-5p 调节神经胶质瘤细胞中的葡萄糖代谢（n=6）

2.3 miR-9-5p 在体外促进神经胶质瘤细胞增殖

增殖检测显示，miR-9-5p 过表达组在处理24 h和48 h 后的细胞活力显著高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而miR-9-5p 抑制剂组与对照组比较，细胞活力在24 h 和48 h 出现明显下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2A～D。

图2 miR-9-5p 促进神经胶质瘤细胞增殖（n=6）

2.4 miR-9-5p 促进体内肿瘤生长

体内实验显示，miR-9-5p 过表达组的肿瘤体积和湿重显著高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3A～B。进一步分 析，miR-9-5p 过表达组 的UBE4B 的蛋白质水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3C。而HIF1α 及糖酵解相关基因（Glut1、HK2 和LDHA）的表达显著高于对照组，差异有统计学差异（P ＜0.05）。见图3D～E。

图3 miR-9-5p 促进体内肿瘤生长

2.5 胶质瘤组织中miR-9-5p 与糖酵解因子相关性

相关性分析显示，miR-9-5p 的表达与Glut1（R2=0.4734，P=0.032）、HK2（R2=0.5837，P=0.004）和LDHA（R2=0.6217，P=0.016）水平呈正相关。

3 讨论

胶质瘤是脑中常见的肿瘤之一，占恶性脑肿瘤的80%[10]。患者经常会出现呕吐、头痛、感觉障碍和反复发作，从而导致生活质量下降。尽管已经采用了影像学、手术、放射疗法等新兴方法进行治疗，但仍无法治愈[11-14]。因此，深入了解胶质瘤的机制对其预防、诊断和治疗具有重要意义。

已有研究显示，miRNA 的失调可以改变包括胶质瘤在内的肿瘤细胞中关键糖酵解酶的表达和活性[15-19]。例如，miR-495 通过直接抑制Glut1 介导神经胶质瘤细胞的新陈代谢[20]。本研究同样发现，miR-9-5p能够影响瓦博格效应[21]，进一步探讨发现其与HIF1α的表达存在同向性且对其mRNA 的表达影响较弱，提示转录后调控可能是miR-9-5p 的主要调控途径。通过对miR-9-5p 靶基因的预测与HIF1α 互作蛋白的分析，筛选出UBE4B 调控的HIF1α 泛素化可能是其中的重要作用途径，这些观点在本研究中得到了有效证明。目前已有多项报道证实泛素化调控在瓦博格效应中的作用[22-25]，本研究创新性地对miR-9-5p在其上游的影响进行了验证，这对未来的靶向治疗提供了重要的参考依据。

综上所述，miR-9-5p 可以通过UBE4B/HIF1α调节神经胶质瘤的瓦博格效应，这些结果可能为癌症治疗提供新的靶向研究方向。