多重RT-PCR MassARRAY技术检测27种呼吸道病原体方法的建立和临床应用评价

刘宏钱， 宋朝晖， 梁巧米

（浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

呼吸道感染是临床较为常见的感染性疾病，尤其是在婴幼儿、老年人和免疫缺陷患者中，常常导致其出现严重的临床症状，甚至死亡。根据世界卫生组织的报道，2016年全球约有300万例患者死于下呼吸道感染[1]。常见的呼吸道感染病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体等。病毒性病原体主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、偏肺病毒、腺病毒等。细菌性病原体有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等。大多数呼吸道感染具有相似的临床症状，导致临床医生很难通过临床症状鉴别病原体，而快速鉴定呼吸道感染的病原体对于临床精准诊断以及用药具有重要意义。过去几年，分子检测技术快速发展，在很大程度上弥补了传统培养和免疫学检测等方法对于呼吸道病原体检测的缺陷，使呼吸道病原体的检测速度更快，灵敏度和特异性也得到了很大的提高。尤其是多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）病原体检测方法的建立及其在临床上的应用，使同时检测多种不同的病原体成为可能。多重PCR检测具有比较高的灵敏度和特异性，但受限于每个反应中荧光类型的数量，一般1个反应孔只能检测3～4种病原体，如果需要检测更多的病原体，则需要更多的反应孔，从而使检测的便利性和检测通量大大降低。基于液相芯片技术的NxTAG Respiratory Viral Panel可以同时检测20种病原体，包括18种病毒及其亚型、肺炎支原体和肺炎衣原体，但该试剂盒成本较高，并未广泛应用于临床。

核酸质谱检测整合了PCR技术的高灵敏度和质谱技术的高通量，1个反应体系最高可实现40重基因扩增，可应用于基因的单核苷酸多态性分析、基因突变检测、DNA甲基化分析和基因拷贝数鉴定等研究[2]。目前，在临床领域的应用主要有耳聋基因检测、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变检测、液体活检和高血压易感基因检测等。本研究拟应用核酸质谱技术同时检测导致呼吸道感染的27种常见病原体，探讨该方法在呼吸道感染病原体诊断中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2019年9月—2020年3月杭州市第一人民医院疑似呼吸道感染患者鼻咽拭子样本207份。患者中男112例、女95例，年龄1～76岁。

1.2 仪器与试剂

2720 PCR仪（美国ABI公司），LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR系统（瑞士罗氏公司），MassARRAY分析系统、Iplex Pro样本鉴定试剂盒、Spectro Chip（美国Agena公司），PrimeScript Ⅱ逆转录酶、TaKaRa Taq Hot Start Version（日本Takara公司），DNA/RNA抽提试剂盒（杭州倍沃医疗科技有限公司），呼吸道病原体检测试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 DNA和RNA的提取

采用DNA/RNA核酸提取试剂盒提取样本DNA和RNA，严格按照试剂盒说明书要求进行操作。

1.4 扩增引物和延伸引物设计

选取病原体基因保守区域，通过MassARRAY Design软件设计扩增引物和延伸引物，引物序列见表1。引物由上海百力格生物技术有限公司合成。

表1 27种病原体对应引物序列

1.5 呼吸道病原体质粒的构建

选取病原体保守区域基因片段（100～300 bp），连接到pUC57质粒载体上，病原体质粒由通用生物系统（安徽）有限公司合成。

1.6 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）及MassARRAY核酸质谱检测

1.6.1 RT-PCR PCR反应体系为40 μL，反应条件：50 ℃ 25 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，45个循环；72 ℃3 min；4 ℃永久保温。

1.6.2 去磷酸化反应 取5 μL RT-PCR产物，加入虾碱性磷酸酶反应液2 μL，45 ℃ 25 min，80 ℃2 min，以去除反应体系中的脱氧核糖核苷三磷酸。

1.6.3 单碱基延伸反应 加2 μL单碱基延伸反应液于去磷酸化反应产物中，然后进行单碱基延伸反应：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃5 s、80 ℃ 5 s（5个循环），30个循环；72 ℃3 min。单碱基延伸反应液中以双脱氧核糖核苷酸代替脱氧核糖核苷三磷酸，仅在特异性延伸引物后面延伸1个碱基即终止反应。

1.6.4 前处理 在9 μL单碱基延伸反应产物中加入16 μL去离子水和6 mg树脂，进行脱盐和检测前处理。

1.6.5 核酸质谱点芯片和质谱检测 基于各病原体延伸产物相对分子质量的差异判读质谱检测结果，在病原体特定产物分子质量位置出现检测峰，则判断为该病原体阳性。

1.7 RT-PCR MassARRAY法呼吸道病原体检测性能评估

利用27种病原体的标准质粒对反应体系的灵敏度进行分析。将质粒稀释成1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL 4个梯度，然后再进行检测。检测结果通过仪器进行自动判读。阳性结果为延伸引物峰降低或消耗干净。并在相应位置出现扩增1个碱基的延伸产物峰，各病原体延伸引物峰序列和相对分子质量以及延伸产物序列和相对分子质量见表2。对每个质粒梯度均进行3次重复试验，3次重复试验结果均为阳性的最低稀释浓度即为最低检出限。将1×104拷贝/μL浓度的各病原体标准质粒分别进行多重RT-PCR检测，评估该检测体系的特异性。若各病原体延伸产物峰出现在特定位置，且产物峰之间不交叉重叠，则认为检测体系特异性良好。

表2 延伸引物、延伸产物序列和相对分子质量

续表2

1.8 RT-PCR MassARRAY法检测呼吸道病原体的临床应用评价

提取207份鼻咽拭子样本核酸，然后分别进行RT-PCR MassARRAY检测和RT-PCR检测、荧光定量检测试剂主要为上海之江生物科技有限公司产品和本实验室自行合成的检测试剂，肠道病毒、博卡病毒、冠状病毒、卡他莫拉菌、人鼻病毒、流感嗜血杆菌、H3N2季节性流感病毒检测引物和探针由本实验室委托上海百力格生物技术有限公司合成，引物和探针序列见表3。比较2种方法的阳性检出情况和一致性。

表3 7种病原体引物及探针序列

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示。对2种检测方法进行一致性分析，以kappa>0.8为结果高度一致。

2 结果

2.1 呼吸道病原体检测灵敏度和特异性

阴性对照和低于检出限的病原体质粒仅有延伸引物峰，无延伸产物峰；而浓度高于检出限的质粒延伸引物峰被消耗，可以看到特定的延伸产物峰。27种病原体质粒检出峰分析结果显示，每种病原体仅出现单一的延伸产物峰，特异性良好。卡他莫拉菌、人鼻病毒、肺炎支原体、冠状病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、A群链球菌、肺炎链球菌、H1N1型甲型流感、副流感病毒3型、副流感病毒2型、腺病毒、H-3型甲型流感病毒、嗜肺军团菌、H3N2季节性流感病毒的检出限为1×102拷贝/μL，乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的检出限为1×103拷贝/μL，肺炎衣原体、H-5型甲型流感病毒、副流感病毒4型、B群链球菌、副流感病毒1型、肠道病毒、H-7型甲型流感病毒、博卡病毒的检出限为1×101拷贝/μL。以肺炎支原体为例，检测结果见图1。

图1 肺炎支原体灵敏度检测质谱图

2.2 临床样本检测结果

用建立的反应体系对207份鼻咽拭子样本进行检测，检出阳性57份，阳性检出率为27.54%。其中感染1种病原体的样本33份，感染2种病原体的样本19份，有5份样本感染3～4种病原体。在所有病原体中，肺炎链球菌检出率最高（9.66%），其次为卡他莫拉菌（5.80%），肺炎支原体和流感嗜血杆菌检出率均为5.31%。有21份样本病毒检测阳性，2份样本存在3种病毒混合感染。病毒检出率居前3位的分别为副流感病毒（1～4型）（10份，4.83%）、人偏肺病毒（7份，3.38%）、甲型流感病毒（6份，2.90%）。双重及多重感染中，与肺炎链球菌合并感染所占比例较高，其中肺炎链球菌合并卡他莫拉菌感染5例、肺炎链球菌合并流感嗜血杆菌感染4例。其他病原体检出情况见表4。

表4 各病原体检出情况 例（%）

续表4

2.3 RT-PCR MassARRAY法与RT-PCR检测结果比较

仅有2份样本2种检测方法检测结果不符，均为RT-PCR MassaARRAY法检测阳性，而RTPCR检测阴性，见表5。2种方法阳性符合率为100%，阴性符合率为98.68%，总符合率为99.03%。2种方法检测结果具有高度的一致性（kappa=0.98）。

表5 RT-PCR MassARRAY法与RT-PCR检出结果比较

3 讨论

近年来，呼吸道感染在全球呈现高发态势，是威胁人类健康的重大的感染性疾病，对体弱多病的老年人和免疫力低下的儿童危害尤为突出。有研究发现，某院12岁以下死亡病例中，有36.7%死于呼吸道感染引起的肺炎[9]。呼吸道感染病原体种类繁多，临床症状相似，给临床诊断和治疗带来了极大的困难。分离培养是病原体诊断的金标准，但其操作繁琐、耗时长，阳性检出率偏低；有些微生物（如支原体、衣原体和病毒）体外培养成功率偏低。血清免疫学检查存在相应的窗口期，受机体抗体产生能力的影响，对病原体早期诊断意义不大。多重PCR技术操作简单、快速，且灵敏度高，在临床中逐渐被应用于呼吸道病原体检测。受荧光通道限制，多重实时荧光PCR单孔只能检测3～4种病原体，如果病原体种类偏多，势必需要多孔检测，使操作更加复杂，对核酸样本的需求也相应增加，同时也使单次检测的通量大大降低。多重PCR技术与质谱相结合的MassARRAY技术可实现单管最高40重的基因检测，同时借助其芯片技术，单次可进行96/384个样本的检测，检测通量极高。

本研究同时对27种病原体进行检测，检测灵敏度为1×101～1×103拷贝/μL，其中仅有2种病原体（乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒）检测灵敏度为1×103拷贝/μL，对其他病原菌的检测灵敏度≤1×102拷贝/μL。由此可见，本研究建立的RT-PCR MassARRAY方法具有较高的检测灵敏度，207例鼻咽拭子样本的阳性检出率为27.54%。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和卡他莫拉菌是社区获得性肺炎和急性细菌感染的主要病原体。本研究中，这4种病原体的检出率高于百日咳杆菌、嗜肺军团菌等其他细菌。本研究还发现，在20例肺炎链球菌感染病例中，单重感染只有9例，仅占肺炎链球菌阳性病例的45%；在11例双重和多重感染病例中，与卡他莫拉菌合并感染的有5例，和流感嗜血杆菌合并感染的有4例，从另一方面证明细菌之间的合并感染是比较常见的，且这3种细菌的耐药情况也不一样[10]。全面、详尽的病原体诊断对指导抗菌药物的合理使用意义重大。本研究207份样本中有21份病毒检测呈阳性（有2份存在3种病毒合并感染），病毒阳性检出率为10.14%；副流感病毒（10份）、人偏肺病毒（7份）、甲型流感病毒（6份）是检出率居前3位的病原体。有研究发现，我国病毒感染高发于秋冬季，春夏季病毒感染率相对较低[11]。本研究采集的样本来自于4～7月的患者，这可能是导致病毒阳性率不高的原因之一。本研究中，有10份样本检出副流感病毒，1型、2型、3型、4型分别为2、3、2、3份，各亚型检出数并无差异，与王春等[12]报道的上海地区副流感病毒1型、2型、3型、4型阳性检出率分别为2.74%、0.62%、8.59%和3.40%有所不同，可能与王春等[12]的研究人群主要以儿童为主，而副流感病毒3型是导致婴幼儿以及免疫功能低下人群下呼吸道感染的主要病因之一[13]有关。本研究中，人偏肺病毒阳性检出率为3.38%，与钟家禹等[14]2018年广州地区人偏肺病毒阳性检出率为3.53%的研究结果较为接近。本研究中，甲型流感病毒阳性检出率为2.90%，且全部为H1N1型，另外还检出呼吸道合胞病毒（2份）、腺病毒和冠状病毒（各1份）。受限于样本数量及样本类型不够丰富，博卡病毒、肠道病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒的一些亚型（H3、H3N2季节性、H5型和H7型）在本研究中并未检出。

本研究建立的RT-PCR MassARRAY法可以对27种呼吸道病原体同时进行检测，其灵敏度和特异性与荧光实时RT-PCR相仿，但相较于实时荧光定量PCR，其优势主要体现在核酸质谱扩增的重数更高，本研究采用的是1个23重和1个4重2孔扩增的模式，4重的扩增孔可以随着新病原体的发现进行相应扩增。MassARRAY采用的是96/384芯片，单次通量最多可进行384个样本的检测，通量较高。基于这个特点，RT-PCR MassARRAY法非常适合临床病原体早期筛查和地区性呼吸道病原体流行病学调查。