CD133和ALDH1在肝细胞肝癌中的临床价值

包大伟， 黄 建

（淮安市第一人民医院病理科，江苏 淮安 223300 ）

目前，肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）已在多种实体瘤，如乳腺癌、膀胱癌、肺癌和结肠癌中被鉴定出[1]。CSC可能是恶性肿瘤中所有肿瘤细胞的来源，与肿瘤的发生、进展、转移及肿瘤细胞的耐药性密切相关[2]。CD133是CSC的标志物[3]，已被用于鉴定多种肿瘤中的CSC。有研究结果显示，CD133的表达与结肠癌[4]和肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[5]的不良预后有关。另外，乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）也是CSC的标志物[3]。覃宇奇等[6]的研究结果显示，ALDH1和CD133与鼻咽癌的病情进展及转移相关。为此，本研究拟探究CD133和ALDH1在HCC中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2020年1月淮安市第一人民医院经病理检查确诊的HCC患者70例（HCC组），其中男29例、女41例，年龄（44.82±6.36）岁，体质量指数（body mass index，BMI）为（23.50±3.50）kg/m2。另选取同期淮安市第一人民医院肝硬化患者70例（肝硬化组），其中男32例、女38例，年龄（47.28±8.22）岁，BMI为（22.01±5.20）kg/m2。以同期淮安市第一人民医院体检健康者70名为正常对照组，其中男31名、女39名，年龄（45.25±8.37）岁，BMI为（22.28±5.52）kg/m2。3组之间性别、年龄及BMI差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经淮安市第一人民医院伦理委员会审查通过，所有对象均知情同意。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）HCC患者均经影像学检查、肝穿刺活检及术后病理检查确诊，肝硬化患者经影像学检查和肝穿刺活检确诊。所有患者均为初诊患者，未合并其他重大疾病，病例资料完整。HCC患者接受手术治疗前未接受过其他治疗，均有乙型肝炎病毒感染史；（2）体检者生化指标均无异常，既往无肝病史，无肝病家族史，无其他重大疾病；（3）所有对象研究期间无失联情况。

1.2.2 排除标准 （1）非初诊患者；（2）合并其他重大疾病者；（3）研究期间失联者。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 收集HCC患者经手术切除的肿瘤组织样本，同时收集对应的无肿瘤细胞浸润的癌旁组织样本作为对照。采集所有患者入院24 h内、体检健康者体检当日的空腹静脉血10 mL，其中5 mL离心分离血清，用于检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、前白蛋白（prealbumin，PA）、甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）和ALDH1水平；剩余5 mL用于流式细胞术检测。

1.3.2 免疫组化 所有组织样本经石蜡包埋，常规切片（厚度4 μm）。CD133免疫组化试剂盒购自德国美天旎公司，严格按说明书进行操作。结果判定：细胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒即判定为CD133阳性细胞，随机选取5个视野（×400），计数阳性细胞数，计算阳性细胞数占视野细胞总数的百分比，以<30%为弱阳性、30%～60%为阳性、>60%为强阳性、无阳性细胞为阴性。免疫组化结果均由2位病理科主治医师独立进行观察判断，以二者均值进行结果判定。

1.3.3 ALT、AST、PA、AFP和ALDH1检测 ALT、AST、PA、AFP和ALDH1试剂均购自北京九强生物技术股份有限公司，AFP参考区间为0～20.0 μg/L，高于参考区间上限即为AFP阳性，反之为阴性。检测仪器为7180型全自动生化分析仪（日本日立公司）。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 流式细胞术检测 取全血样本2.4 mL，裂解红细胞后离心弃去上清，重悬于100 μL 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）中，采用FACSCanto流式细胞仪（美国BD公司）进行白细胞（white blood cell，WBC）计数，检测淋巴细胞绝对数（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）。另取全血样本2.4 mL，裂解红细胞后离心弃去上清，重悬于100 μL PBS中，加入藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的CD133单克隆抗体（德国美天旎公司），室温孵育45 min，PBS洗涤3次，用500 μL PBS重悬，采用FACSCanto流式细胞仪检测CD133百分比（CD133%）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价各项指标诊断HCC的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组、肝硬化组及HCC组一般资料比较

正常对照组、肝硬化组及HCC组之间LYMPH#、ALT、AST、PA、AFP差异均有统计学意义（P<0.001），WBC计数3组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 正常对照组、肝硬化组及HCC组一般资料比较 ±s

表1 正常对照组、肝硬化组及HCC组一般资料比较 ±s

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与肝硬化组比较，#P<0.05；空白表示无此项。

组别 例数 WBC计数/（×109/L）LYMPH#/（×109/L） ALT/（U/L） AST/（U/L） PA/（g/L） AFP/（ng/mL）正常对照组 70 5.39±1.02 1.63±0.51 28.40±5.60 29.23±4.94 248.29±19.84 5.78±1.42肝硬化组 70 5.19±0.92 1.43±0.21* 48.23±15.94* 58.33±17.94* 88.29±11.64* 23.20±11.51*HCC组 70 5.09±0.82 1.18±0.31*# 52.13±15.34* 62.53±15.70* 118.09±16.64*# 68.43±20.45*#统计值 1.915 25.729 65.298 116.522 1 886.345 397.320 P值 0.150 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 正常对照组、肝硬化组及HCC组外周血CD133%及血清ALDH1水平的比较

HCC组外周血CD133%及血清ALDH1水平显著高于肝硬化组和正常对照组（P<0.001），而肝硬化组与正常对照组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 正常对照组、肝硬化组、HCC组外周血CD133%及血清ALDH1水平的比较 ±s

表2 正常对照组、肝硬化组、HCC组外周血CD133%及血清ALDH1水平的比较 ±s

注：与HCC组比较，*P<0.001；空白表示无此项。

组别 例数 CD133%/% ALDH1/（ng/mL）HCC组 70 0.79±0.02 31.55±5.42肝硬化组 70 0.03±0.01* 4.92±1.31*正常对照组 70 0.02±0.01* 4.11±0.76*F值 68 285.00 1 616.57 P值 <0.001 <0.001

2.3 CD133蛋白在HCC组织和癌旁组织中的表达

免疫组化结果显示，HCC组织CD133的阳性表达率为60.00%（42/70），高于癌旁组织[14.29%（10/70）]（χ2=31.33，P<0.001）。

2.4 外周血CD133%、血清ALDH1水平与HCC患者临床病理特征的关系

外周血CD133%与肿瘤细胞分化程度、肿瘤大小和TNM分期有关（P<0.001），与年龄、性别无关（P>0.05）。血清ALDH1水平与肿瘤分化程度和TNM分期有关（P<0.001），与年龄、性别和肿瘤大小无关（P>0.05）。见表3。

表3 外周血CD133%和血清ALDH1水平与HCC患者临床病理特征的关系

2.5 各项指标诊断HCC的效能

ROC曲线分析结果显示，外周血CD133%及血清ALDH1、AFP水平诊断HCC的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.588、0.635、0.877，最佳临界值分别为0.61%、5.35 ng/mL、3.33 ng/mL，敏感性分别为84%、79%、78%，特异性分别为65%、63%、62%。见图1。

图1 外周血CD133%和血清ALDH1、AFP水平诊断HCC的ROC曲线

2.6 外周血CD133%、血清ALDH1水平诊断AFP阴性HCC的效能

70例HCC患者中有19例AFP为阴性。ROC曲线分析结果显示，外周血CD133%及血清ALDH1水平诊断AFP阴性HCC的AUC分别为0.835、0.853，最佳临界值分别为0.71%、5.67 ng/mL，敏感性分别为84%、78%，特异性分别为70%、63%。见图2。

图2 外周血CD133%和血清ALDH1水平诊断AFP阴性HCC的ROC曲线

3 讨论

CD133是一种位于细胞膜上的糖多肽，是传统造血干细胞、内皮细胞和血液肿瘤细胞的标志物，位于细胞膜的微突出处，这一部位是维持细胞干性的关键区域，主导细胞的分化。有研究结果显示，在肝外胆管癌组织中，CD133表达阳性率显著高于癌旁胆管组织和正常胆管组织（P<0.05）；CD133的表达与肝外胆管癌的TNM分期、肿瘤细胞分化程度和转移有关（P<0.05），且与另一干细胞转录因子八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）的表达呈正相关（r=0.33，P<0.05）[7]。Oct4和CD133均可作为评估肝外胆管癌生物学行为和预后的参考指标[7]。张泽峰等[8]的研究结果显示，虽然CD133阳性肺癌患者（75.00%）和CD133阴性肺癌患者（83.30%）1年生存率差异无统计学意义（P=0.149），但CD133阳性肺癌患者2年生存率（45.83%）和3年生存率（25.00%）明显低于CD133阴性肺癌患者（61.11%、50.00%）（P值分别为0.031、0.000），表明CD133高水平表达提示患者预后不良。本研究结果显示，HCC组外周血CD133%显著高于肝硬化组和正常对照组（P<0.001），且HCC组织中CD133的阳性率（60.00%）显著高于癌旁组织（14.29%）（P<0.001），与文献报道[9]一致。提示CD133具有作为HCC诊断标志物的潜力。

ALDH1也被认为是CSC的标志物，在多种恶性肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌中表达升高[10]。杨丽青等[11]的研究结果显示，高水平的ALDH1预示着乳腺癌预后不良。本研究结果显示，HCC组血浆ALDH1水平显著高于肝硬化组和正常对照组（P<0.001）。这提示ALDH1在HCC的辅助诊断中有一定的价值。

本研究结果显示，外周血CD133%与HCC的分化程度、肿瘤大小和TNM分期有关（P<0.001），与年龄、性别无关（P>0.05）。血清ALDH1水平与HCC的分化程度和TNM分期有关（P<0.001），与年龄、性别和肿瘤大小无关（P>0.05）。这提示ALDH1和CD133与HCC病情的严重程度有关。

本研究ROC曲线分析结果显示，外周血CD133%及血清ALDH1、AFP诊断HCC的AUC分别为0.588、0.635、0.877，外周血CD133%及血清ALDH1诊断AFP阴性HCC的AUC分别为0.821、0.850，提示外周血CD133%及血清ALDH1对AFP阴性HCC有较高的辅助诊断价值。

综上所述，CD133和ALDH1在HCC的辅助诊断和病情判断中有一定的临床价值，对于AFP阴性HCC的辅助诊断效能更高，因此可作为HCC辅助诊断的补充指标。