基于问题解决的“蛋白质工程的原理和应用”教学设计

王岳琼 白建秀

（1 北京中学 北京 100028 2 北京朝阳区教育研究中心 北京 100124）

问题解决是以问题引导的方式，促进学习者的思维发展的教学模式[1]。基于解决真实问题的教学，在解决问题过程中获取知识，形成概念，有利于培养学生的问题意识，提高学生解决问题的能力。在“蛋白质工程的原理和应用”一节的教学中，设计利用纤维素酶改造的过程设置真实问题，引导学生在解决问题中提升科学素养。

1 教学内容分析与设计思路

蛋白质工程是在基因工程的基础上，实现对蛋白质进行改造的工程技术。这部分内容既联系学生前期所学的蛋白质与基因之间的关系，又涉及具体的分子、细胞水平的操作技术。学习本部分内容有利于学生将前、后所学知识联系成体系，理解科技与现实生活的紧密联系。

在真实的科研问题情境中，学生在学习中不断地经历提出问题、解决问题、出现新问题、再解决问题的过程，有利于其习得新的生物学知识，养成科学思维习惯。

本设计以生产中纤维素酶改造遇到的真实问题为例，引导学生利用所学知识解决问题，同时形成蛋白质工程的概念，并体会科技水平的进步对现实生活的影响。在学习纤维素酶改造的过程中，形成“蛋白质工程是基因工程的延伸”这一概念。

2 教学目标

1）用结构与功能观和信息观，概述利用基因工程原理设计和改造蛋白质获得性状和功能更符合人类需求的基本思路或流程。

2）在给定情境或解决问题的过程中，能基于事实和证据运用归纳与概括、批判性思维等方法，比较基因工程与蛋白质工程的区别与联系。

3）针对人类生产、生活的某一需求，尝试提出初步的工程学构想，并进行简单的设计。

4）认同蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前已展示出诱人的前景并将给人类带来更多的福祉；运用蛋白质工程原理对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白，参与科学问题的讨论。

3 教学过程

3.1 创设情境，引入新课 纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖有机物。利用廉价的纤维素材料生产生物基产品和生物能源，可缓解世界范围内日益突出的粮食和能源短缺问题，对人类的可持续发展具有重要意义[2]。学生已知构成纤维素的单体是葡萄糖。教师介绍葡萄糖构成纤维素的方式——纤维素中的葡萄糖之间通过β-1，4 糖苷键连接，以及纤维素在生产、生活中的应用。纤维素酶可分解纤维素。Zhang 等[2]总结了纤维素酶的作用机理（图1）。

图1 纤维素酶的作用机理[2]

分析图1 可知，纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶在发挥催化功能时，切断纤维素的β-1，4 糖苷键，产生纤维二糖、纤维糊精等产物。之后，β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。

教师介绍上述内容，为学生后续学习纤维素酶的改造作铺垫。

3.2 发现问题，探明究竟 教师指出，实际应用时发现，在催化纤维素分解的过程中，酶的活性会下降。提问：引起酶活性下降的原因是什么？

学生的讨论主要集中在以下3 个方面。1）可能是纤维素混有的杂质抑制了酶的活性。2）可能是酶与纤维素反应过程中没有充分混合均匀，导致糖的产量随时间推移而下降，而被误认为是酶活性下降。3）可能是产物抑制了酶的活性。

教师讲解：通过研究人员的实验，发现产物纤维二糖会抑制葡聚糖酶的催化活性，从而限制从生物体中提取纤维素酶直接用于生产。提问：如何找出纤维二糖抑制酶活性的原因？

学生讨论：因为酶的结构决定其功能，所以，可能是纤维二糖与酶的相互作用改变了酶的结构，从而降低了酶的活性。可通过研究纤维素酶的结构，探索纤维二糖和纤维素酶之间的相互作用。

教师介绍：外切葡聚糖酶是蛋白质，是由氨基酸脱水缩合形成的肽链构成的，肽链盘曲、折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。图2 是外切葡聚糖酶的结构简图，外切葡聚糖酶分为催化区域、纤维素结合区域及二者的连接区。

图2 外切葡聚糖酶的结构[2]

外切葡聚糖酶在发挥作用时，利用纤维素结合区域与纤维素的多糖链结合。然后，催化区域切断纤维素的β-1，4 糖苷键，产生纤维二糖、纤维糊精等产物。如图3 所示，水解出的纤维二糖会与酶催化区域的第248 位的精氨酸和第385 位酪氨酸的侧链基团发生相互作用，形成封闭结构，阻碍了纤维二糖的释放，继而抑制酶的催化活性，从而出现产物抑制酶活性的现象。

图3 外切葡聚糖酶的催化区域的结构[3]

3.3 寻找出路，实验求证 教师提问：如何解除纤维素降解产物纤维二糖对外切葡聚糖酶活性的抑制？

学生讨论并提出解决思路：及时清除反应的产物纤维二糖；或通过直接改变酶的某些基团，或改造相应基因等方法，调整酶与产物的相互作用。结合学生的讨论，教师提问：蛋白质是由氨基酸构成的，如何改变蛋白质中的氨基酸？如何确定针对纤维素酶基因序列中哪几个碱基进行操作？

研究人员利用PCR 等技术手段，对纤维素酶催化区域的编码基因进行改造。例如，通过查阅密码子表，知道UAC 是酪氨酸对应的一种密码子，结合中心法则的碱基互补配对关系，可推测出相应的基因中对应碱基排序为ATG/TAC。可将DNA 上的碱基由ATG/TAC 变为CGG/GCC，改变了基因序列中的2 个碱基对，从而可将第385 位的酪氨酸变为丙氨酸。将改造成功的基因转入受体细胞，可生产出改造后的蛋白质。新合成的纤维素酶与纤维二糖不再形成上述封闭结构，使得纤维二糖可顺利地从酶的催化结构区域释放，解除了产物的抑制作用，并通过实验再次检测改造后的效果（图4，Y385A 为改造后的突变体）。

图4 纤维二糖对酶的抑制作用比较[3]

上述解决纤维二糖的产物抑制问题时采用的方法，称为理性蛋白质设计方案（图5）。这一方案是根据对蛋白质功能的预期，结合蛋白质的结构与功能的关系，对蛋白质结构进行设计，再通过定点突变技术，改造相应基因，并将基因导入到微生物细胞中表达出新的蛋白质。多次重复上述过程，最终可获得期待的蛋白质。

图5 理性蛋白质设计方案[2]

利用此法是否可完美地改造蛋白质？教师提供另一组实验数据（图6）。

可用总糖释放量衡量酶的活性。通过定点突变技术缓解了纤维二糖对酶的抑制作用，但因为酶结构的改变，导致改造后酶的活性与野生型相比有一定程度的降低。虽然此法没有显著提高酶的活性，但却使学生对纤维素酶催化区域内部氨基酸之间的相互作用关系及其与酶功能的关系有了进一步的了解，可在这一研究的基础上继续对酶进行改造。

通过改造纤维素酶的实例，学生体会到蛋白质结构和功能的关系，理解科学研究是在不断地提出问题、解决问题、再提出问题过程中进步的。

结合这一实例，师生总结理性设计蛋白质改造方案的优、缺点。理性设计改造蛋白质，基于可从结构预测功能这一科学知识。利用此法可通过改造基因，精确地改造蛋白质。但自然界中不同种类纤维素酶的编码基因差异较大，而相应的酶功能却差别不大。此外，目前的研究显示，蛋白质不但在数量上远超基因，而且蛋白质的可变性和多样性，导致对蛋白质的研究较核酸更复杂和困难。对蛋白质分子结构的设计还有很多知识和经验需要积累。目前，未精确了解蛋白质的结构及结构与功能的关系，即进行定点突变的方案设计，难度较大，成功率不高。然而，有时定点突变虽不能得到预期的蛋白质，但定点突变后获得蛋白质功能或结构的改变，有利于进一步了解蛋白质的氨基酸排序与空间结构的关系、空间结构与蛋白质功能的关系。这一技术可不断加深对蛋白质结构和功能关系的理解。

根据酶在实际生产中应用遇到的问题，师生共同总结解决方案的思路（图7）。

通过教师的提问，引导学生将已学的蛋白质结构与功能的关系、基因与蛋白质的关系等基本生物学理论知识应用于实践。

3.4 又生疑惑，继续探求 提问：理性设计蛋白质的技术成功率不高，怎样解决这一问题？学生思考后，教师提供科研实例。

研究人员选用枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因，利用PCR 等方法，获得突变基因，将获得的突变基因转入微生物细胞中，进而构建突变体文库，合成改造后的蛋白质，再应用刚果红染色法进行筛选。图8 展示利用刚果红染色法比较9 个突变体的纤维素酶降解活力。

图8 纤维素酶改造的定向进化方案[4]

科研人员具体的做法是，第1 轮得到天然的内切葡聚糖酶基因后，对内切葡聚糖酶基因进行操作，使之发生随机突变，从3 万多个克隆的文库中筛选出14 个比亲本透明圈更大的突变体；第2 轮，在第1 轮筛选的基础上，继续使用易错PCR 的方法，从随机突变体库约3 万个克隆中选出11 个透明圈较大的突变体；第3 轮，利用前2 轮随机突变筛选得到的25 个改良基因，进行基因重组筛选出约1.2 万个克隆，从中获得12 个水解活性比亲本提高的重组子。

引导学生分析这种方法的基本思路。此方案是模拟自然进化过程。现代生物进化理论的基本内容是：自然界中生物会产生变异，变异方式包括突变和基因重组。通过不定向的变异，产生了多种不同类型的生物。在自然选择的作用下，具有有利变异的个体有更多的机会遗传这些变异，而具有不利变异的个体则容易被淘汰。此机制使生物朝着一定的方向不断进化。

模拟自然进化过程展开的蛋白质改造的方法，称为蛋白质定向进化方案[2]（图9）。此法是在对蛋白质的结构及催化机制了解不确切的条件下，预期蛋白质的功能，在体内或体外对原有蛋白质编码基因进行随机突变或体外基因重组，构建突变基因库。之后，将改变后的基因转入微生物细胞，在微生物细胞中表达出相应的蛋白质。多次重复上述过程，逐渐筛选、得到符合预期功能的蛋白质。上述实例，科研工作者利用蛋白质定向进化方案，最终获得的纤维素酶水解纤维素的活性较最初的亲本提高了2.68 倍。

图9 蛋白质定向进化方案[2]

教师引导学生评价蛋白质定向进化方案。在对要改造的蛋白分子结构信息并不清楚的条件下，定向进化技术在对纤维素酶进行改造时可能会得到意想不到的“有益收获”，但操作具有明显的“盲目性”。假设1 个纤维素酶分子由300 个氨基酸组成，其可能的序列数目将达20300，而其中有益的突变或组合突变会非常少，这使得筛选有效突变体的工作强度非常大，同时极大降低了其改造的有效性。

让学生深入探讨如何克服上述缺点？例如，可构建有效的突变体文库，建立合理筛选突变体及正确评价各突变体性能的方法等。

教师介绍基于结构生物信息学的纤维素酶结构理性设计。随着后基因组时代的到来，糖苷水解酶数据库中收录的纤维素酶基因序列数目呈现爆炸式增长。蛋白质组学数据的快速增长推动了后基因组时代基于蛋白质家族或基于结构生物信息学的理性设计新策略的形成。其特点是结合了理性设计与定向进化的优势，通过一定的计算模拟与预测指导纤维素酶的改造。当然，大量信息的共享和计算、模拟、预测方法预期蛋白质结构后，仍然要利用基因工程技术获得改造后的基因与蛋白质。数据驱动设计与结构生物信息学指导的纤维素酶结构理性设计必将成为后期分子改造的主流方向，也将会为进一步满足生物能源快速发展的需求提供一定的可能。

3.5 构建概念，总结提升 引导学生总结改造纤维素酶采用的3 种方法技术流程。这3 种方案，均首先预期了蛋白质的功能，之后，根据对蛋白质功能的预期，设计蛋白质的结构，通过蛋白质的氨基酸与基因中碱基的对应关系，改造蛋白质对应的基因；获得改造的基因后将基因导入到细胞中，得到符合预期的蛋白质。此过程称为蛋白质工程（图10）。

图10 蛋白质工程的技术流程

引导学生从蛋白质工程的理论基础、实现途径及目的3 个方面尝试为蛋白质工程下定义。

蛋白质工程的定义：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。

师生共同总结蛋白质工程和基因工程的区别和联系（表1）。

表1 基因工程与蛋白质工程的区别和联系

3.6 展望 通过蛋白质工程，在生产中改善纤维素酶的性能，降低纤维素酶的生产成本，对于降低生物炼制的加工成本都是至关重要的。科技的进步可将设想逐步变为可实施的现实，为生活提供更大的便利。蛋白质工程在医学领域、药物研发领域也取得了很多有价值的研究成果：例如，干扰素体外保存很困难，利用蛋白质工程改造干扰素，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，改造后的干扰素在-70℃条件下可保存半年之久。还可设计自然界中没有的、全新的蛋白质——这些需要依靠创造力和想象力。

4 反思

本教学设计通过问题引领学生思考纤维素酶的改造方法，形成“蛋白质工程是基因工程的延伸”这一概念。在思考纤维素酶的改造方法、解决实际问题过程中，学生体会科学研究是在提出问题、解决问题、再提出问题、解决问题过程中不断进步的。在分析改造纤维素酶遇到问题的过程中，让学生体会蛋白质结构与功能观、认识到知识的积累、数据的共享在解决实际问题中的重要性，体会科学与技术的关系，同时认识到科技的进步不是一蹴而就的，需要多代人的共同努力。最后列举实例，使学生体会到科技进步对生活的影响。

在学习本部分内容时，学生经常混淆蛋白质工程和基因工程，认为蛋白质工程就是基因工程。本节教学中，通过分析纤维素酶的改造，学生结合自己所学的蛋白质和基因之间的关系、进化等知识解决问题，并在运用这些知识解决问题过程中，意识到蛋白质工程与基因工程的内在联系和区别。