实时荧光定量PCR实验中常见的几个关键注意事项

周爱军 程泽影

近年，从科学研究到临床检测，从“非洲猪瘟”的检测到“新冠病毒”的检测，荧光定量PCR仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展，检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求，需要他們具备熟练操作能力和分析判断数据结果的能力。对于荧光定量PCR结果，最直观的判断就是看CT值和扩增曲线是否正常。很多人在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰，比如，核酸污染风险引起样本阳性、打折的扩增曲线、复孔间重复性不好和阴性样本扩增曲线抬升等。面对异常的扩增曲线，笔者将从以下几个实例分析比较常见的异常扩增曲线产生的原因及其解决办法。

一、确定是否有核酸污染风险的存在

由于在实验过程中，容易产生气溶胶，造成样本阳性，所以要做好设施和环境的消毒处理。

（一）有效消毒剂的选择

消毒剂包括邻苯基苯酚、次氯酸盐、强碱类及戊二醛等。我们要根据不同的需要来选择，如碱类（氢氧化钠、氢氧化钾等）、氯化物和酚化合物适用于建筑物、木质结构、水泥表面、设施设备的消毒，而酒精和碘化物适用于人员消毒。消毒剂必须有效，如“非洲猪瘟”病毒，用0.8% 氢氧化钠、含 2.3% 有效氯的次氯酸盐、0.3%福尔马林溶液、3%邻苯基苯酚和3%碘化合物，处理 30 min即可将其杀灭。

（二）仪器设备和环境的消毒

1.生物安全柜内消毒。如进行“非洲猪瘟”检测活动时应在生物安全柜中操作区铺隔水垫，实验后卷起隔水垫置于污物桶后消毒灭菌，采用有效消毒剂将生物安全柜内操作区消毒处理1遍，再用清水浸泡纱布或吸水纸清洗1～2 遍。

2.剪刀、镊子等可重复使用物品消毒。剪刀、镊子等可高压灭菌的物品直接置于锐器盒高压灭菌处理。不能高压灭菌的物品考虑消毒剂浸泡，可用塑料盒盛装有效消毒剂进行浸泡处理 30 min。不能用消毒剂浸泡但可高压处理的，可放进生物安全灭菌袋后直接高压蒸汽消毒（121 ℃，30 min）。

3.仪器、工作台面、地面、环境消毒。消毒的频次可根据做实验次数的多少来定，少时14 d消毒1次，多时7 d消毒1次。可用紫外线灯消毒30～60 min，但紫外线灯用久后不能起到杀灭微生物的效果，所以实验结束后，仪器、工作台面、地面、环境均应用消毒液喷洒擦拭消毒。对金属仪器等消毒时应防止对仪器的腐蚀。实验过程中若出现样品溢洒或容器破碎等情况，发生小量液体样品溢洒时，应用吸水纸吸干，然后在表面喷洒有效消毒剂进行处理。发生大量液体样品溢洒时，应该立即用毛巾或纸巾覆盖感染性物质及相关破碎物品，然后在上面喷洒有效消毒剂，消毒30 min。再对吸水毛巾或纸巾以及破碎物品进行清理（玻璃碎片应用镊子清理），然后再用有效消毒剂喷洒或擦拭污染区域。清理完毕后，应对清洁用具及垃圾进行高压灭菌。检验人员在整个操作过程中应佩戴手套。清理操作区域及环境消毒完毕后，如水分蒸发导致台面、内壁等出现白色结晶现象，应采用蒸馏水喷洒擦拭清理干净。另外，还要开负压空气过滤装置，保持实验室洁净。

二、确定荧光定量PCR仪操作软件设置的正确与否

实验前检验员要对照试剂盒说明书，检查荧光PCR仪设置的加热时间、保持的温度、循环的次数、荧光信号的采集和通道等是否与试剂盒说明书设置的要求一致。有一个比较容易忽略的设置问题是需要看一下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。有的荧光定量PCR 仪可以用ROX来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差。例如，均一化的校正作用，由于移液误差或者蒸发导致的一批荧光反应管内的体积误差等。目前，市面上有的荧光定量PCR试剂盒预混液是不含有ROX参比荧光染料的，如果用此类试剂盒时，应将ROX参比功能关闭，否则可能会出现围绕基线上下波动的“锯齿状”扩增曲线。遇到这种问题，可以在“菜单设置”中找到“参比荧光染料”功能，将ROX改为None，重新将样本加入含荧光反应液和聚合酶的反应体系中重新进行扩增分析，结果就正常了。切记不要将原来的反应管重新进行扩增1次，如果这样，扩增曲线是一条直线，结果呈阴性，从而造成检验结果的错误。有的荧光定量PCR 仪默认是对所有荧光通道及所有样品孔进行荧光采集，用户不用害怕数据丢失，实验结束后，可对仪器设置错误的反应孔的荧光通道、样品名称等进行更改，结果就会显示出正确的扩增曲线。

还有可能出现其他一些异常结果。如多组分图扩增曲线没有抬升，本应是很明显的阴性样本，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样抬升曲线就会与阈值线相交，反而出现了CT值。这主要是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现了错误，引起了扩增曲线的抬升。出现这种情况首先可采取手动调整基线的方法，重新定义基线就可恢复正常。即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3）;基线终点则改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第25个循环，那基线的终点就是24）。另外，引起这种现象发生的原因是所选耗材、试剂或者操作导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误，导致扩增曲线的抬升。

三、确定耗材和仪器配件是否使用正确

耗材对于荧光定量PCR来说非常重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。

（一）错误使用普通PCR仪器所对应的耗材

普通PCR耗材一般透光性不均匀，会造成荧光透过比较薄的地方，荧光信号强;透过比较厚的地

方，荧光信号弱。这样会导致扩增荧光信号曲线时而上抬、时而下降的异常变动，从而出现扩增曲线打折的现象。

（二）未选择跟仪器加热模块规格相匹配的耗材

有的荧光定量PCR 仪加热模块分为两种，实验前一定要确定好自己的仪器是哪一种加热模块，再来选择相对应的实验耗材。如果小的加热模块使用较大的耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器出现故障并出现报警的现象;如果大的加热模块使用较小的耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响聚合酶的活性，结果会引起同一个检测样本重复性不好，或者出现非特异扩增（溶解曲线多峰）现象，有的甚至出现假阴性的结果。

（三）使用了质量比较差的耗材

大部分荧光定量PCR仪器是一个开放的平台，客户可以使用开放的試剂、开放的耗材。但是目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多，质量也是千差万别。在耗材选择上，尽量选择一些名牌企业的优质产品，不要因为便宜选用质量差或不符合要求的实验耗材，带来不必要的实验错误。例如，使用质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定，从而造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值;使用质量好的耗材，荧光信号正常，会出现明显指数增长曲线和CT值。如果使用PCR封膜质量不好的反应管，在PCR扩增加热过程中又受到蒸发的热水蒸气的影响，容易产生变形，这样会引起“荧光的折射”，即“光学扭曲”现象。该实验如果使用了ROX作为参比荧光染料，ROX就会有效地校正这种荧光信号偏差，出现均匀的扩增曲线，其结果才是正常的。

四、确定所使用的试剂是否正常

如果无核酸污染风险的存在、软件设置都正确、实验耗材及配件也没有问题，但是扩增曲线还是异常，这个时候就要确定所用试剂是否正常。

（一）确定试剂是否有效

确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号，结合实验中的阳性、阴性对照结果，若阴性对照出现非特异性起跳，要先结合同一阴性对照的多组分图，看看是否有扩增曲线;如果是由于背景荧光波动导致基线自动扣除错误导致的起跳，可通过手动调整基线的方式进行更改。如果是染料法实时荧光定量PCR实验，可以通过溶解曲线来判断是污染，还是引物二聚体;如果是探针法实时荧光定量PCR实验，则可能是污染导致的起跳。只有阳性、阴性对照结果正确，才能确定试剂的有效性。

（二）观察扩增后的试剂体积

如果在扩增过程中试剂中的水分蒸发，可能会引起扩增体系中扩增物质浓度增高，在发射光源的照射下，荧光信号增强（荧光信号的强度与扩增物浓度呈正相关），出现荧光扩增曲线抬升的现象。如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光对照，ROX参比荧光染料可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是试剂蒸发引起的扩增。如果参比荧光物质的反应管没盖好或者使用了PCR封膜质量不好的反应管，就会造成ROX反应体系有蒸发和水分丢失的现象，ROX参比荧光染料的浓度会逐渐地增加，结果就出现ROX参比荧光扩增曲线抬升现象，而正常孔中ROX荧光会一直不变。所以在做PCR实验加完试剂上机扩增时，一定要检查PCR反应管是否已经盖好并且密封严实。这样既防止试剂蒸发影响检测结果，又防止试剂蒸发形成气溶胶。

五、确定实验过程中的操作细节是否有误

如果以上都正常，还要注意实验过程中的操作细节。例如，在做标准曲线的时候，是不是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释的标准品，可能会引起标准曲线扩增的效率或者R2值的异常。从冰箱冷冻室中取出的试剂是不均匀的，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂是不均匀的，会影响后面的扩增。定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR反应体系的20%），更容易发生“光波混频”现象。因为核酸样本是水相，会在反应体系的上层;试剂含有甘油等成分，会在下层。在前期的PCR扩增过程中不足以完全混匀，这样会形成荧光信号的折射，这时发出的荧光信号较强，就会出现扩增曲线向上抬的现象。再继续加热和降温进行几个循环后，由于液体分子的热运动加快，很快样本跟预混液混匀，荧光就会稳定了。