不同引发方法对青绿苔草种子发芽的影响

李 慧，滕 珂，岳跃森，滕文军，温海峰，韩 朝，张 辉，范希峰，武菊英

（1.北京市农林科学院，北京 100097；2.北京农学院园林学院，北京 102206）

青绿苔草(Carex leucochlora)属莎草科苔草属多年生草本，耐寒、耐热、耐旱，喜湿润[1]。在对北京地区代表性的草坪地被植物蒸散速率的研究中发现青绿苔草的蒸散速率明显低于高羊茅(Festuca arundinacea)[2]，通过对青绿苔草光合作用日变化及季节动态进行研究，发现其蒸腾速率和气孔导度较低，水分利用效率较高，既耐旱又耐阴[3]；青绿苔草对土壤的适应幅度也较宽，发达的根网增强了其耐刈割性与耐践踏性，同时，其有较强的分蘖能力，且叶的分生组织处于近地表基部，可使其生长点不易受损害而具有极强的再生能力；青绿苔草可在短时间内达到草丛最大高度，且常年保持同一高度。这些优良性状对于在温带建造常绿或夏绿草坪有较高的价值[4]。目前我国北方地区园林绿地中的草坪多由冷季型草建成，该草坪覆盖效果好、建成快，但存在许多问题，例如草种高度依赖进口、草坪耐阴性差、耗水高且建坪后养护成本高，这些问题促使耐阴、覆盖效果好、节水、低维护的草坪地被植物急需被开发，青绿苔草因具优良成坪性状而使得其开发利用更具发展前景。然而青绿苔草是密丛根茎型植物，繁衍较慢，占空力弱，仅用无性繁殖建坪势必加大成本投入，必须依靠有性繁殖适当密植，才能尽快形成郁蔽的草坪。在有性繁殖下，青绿苔草种子成熟良好，产种量高，但播种后种子发芽时间长，不具冷季型草快速成坪的优势，因此解决其生物学问题为现阶段研究工作的重中之重[4]。

目前国内对青绿苔草种子萌发特性的研究较多，例如，杨学军等[5]研究发现不同光照条件对青绿苔草种子发芽率没有很大影响，但对发芽指数影响极显著，相比于黑暗条件，光照能够提高其出苗速率；同时发现青绿苔草种子萌发最适温度为15℃/25℃的变温处理，发芽率可达95%；罗弦[6]对青绿苔草种子进行层积处理，发现其发芽率无明显变化，但发芽指数显著提高；同样用GA3处理青绿苔草种子时，其发芽率无显著提高，但发芽指数有所增加；鲍晓彤[7]在对青绿苔草种子进行NaOH处理10 min，不同浓度整体效果均较好，发芽率较高；有研究表明，青绿苔草种子发芽时间长达24 d[6]。就此看来，目前对于青绿苔草种子发芽时长这一问题还未有效解决。

随着种子科学与技术的发展以及种子生物学的深入研究，种子引发技术日益成熟，可通过控制种子缓慢吸收水分使其停留在吸胀的第二阶段，让种子进行预发芽的生理生化代谢和修复作用，处于准备发芽且胚根未伸出的代谢状态[8]。种子引发能简单有效地提高逆境下植物种子的活力，增强种子抗性，使其出苗快而且成苗率高[9]。种子引发技术主要包括渗调引发、滚筒引发、起泡柱引发、搅拌型生物引发、固体基质引发、水引发以及生物引发。刘杰等[10]用30%的PEG 引发处理羊草(Leymus chinensis)种子24 h，显著提高了羊草种子的发芽率和幼苗活力；西红柿(Solanum lycopersicum)种子[11]经−1.25 MPa的PEG-6000渗透引发2 d 后，与未引发种子相比，显著提高了其发芽率；野牛草(Buchloe dactyloides)[12]、烟草(Nicotiana tabacum)[13]种子经赤霉素处理后，发芽率、发芽势、发芽指数等活力指标均有提高；沙引发可显著提高紫花苜蓿(Medicago sativa)种子[14]盐逆境下的发芽率、发芽势及发芽指数，缩短平均发芽时间；水引发处理柳枝稷(Panicum virgatum)种子后，其发芽率及幼苗生长量有所提高[15]；甜玉米(Zea mays)通过加压融合生物引发即采用增加空气压力，加速种子水合，促进生物控制剂致金色假单胞菌进入其种子，播种后可明显增加出苗率[16]。种子引发技术多见于蔬菜、花卉和农作物，而对青绿苔草种子的引发研究尚无报道，因此本研究通过不同引发方法对青绿苔草种子发芽的影响，探究最佳引发试剂、引发浓度，在此基础上，通过多种引发剂混合引发种子，进而寻求最佳处理方案，以期解决青绿苔草种子出苗慢的问题，为进一步探究引发技术对其发芽作用机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试青绿苔草种子2020年5月采集于北京农林科学院小汤山试验基地，参照韩建国[17]的方法，测定种子初始含水量为5.80%，发芽率为97%，发芽指数为4.35；本试验在北京市农林科学院实验室光照培养箱进行，光周期为光照16 h，黑暗8 h，温度为25℃，湿度60%～80%。

1.2 试验方法

选取饱满的青绿苔草种子放入50 mL 离心管中，用10%次氯酸钠浸泡20 min 进行消毒处理，期间不断摇晃，消毒后用蒸馏水冲洗5～6次，沥干水分待用。每个处理50粒消毒后的种子，重复3次，引发时引发剂完全浸没种子，置于25℃黑暗环境下引发24 h[18]，引发后用蒸馏水洗净，经室温(18～25℃)下回干48 h[19]时，测定种子含水量约为初始含水量，此后用于发芽试验。发芽试验以50粒种子为1次重复，将其置于内部垫有3层滤纸、12 cm×12 cm×5 cm 的发芽盒中，用蒸馏水培养，共3次重复，发芽盒放于光照强度为24 000 lx 的光照培养箱中培养，每天定时定量补加蒸馏水，使其保持湿润，以胚根突破种皮超过种长1/2为发芽标准，开始计数，每天统计一次发芽数，试验期限设定为30 d[5]，计算发芽势、发芽率、发芽指数及平均发芽时间。

1.2.1 不同浓度试剂引发处理

设PEG-6000溶液浓度梯度：0(CK：未经任何处理)、5%、10%、15%、20%和25%；CaCl2溶液浓度梯度：0(CK)、5、10、15、20和25 mmol·L−1；NH4NO3溶液浓度梯度：0(CK)、0.02%、0.04%、0.08%、0.12%和0.20%；KNO3溶液浓度梯度：0(CK)、5%、10%、15%、20%和25%；GA3溶液浓度梯度：0、60、120、240、480和960 mg·L−1。

1.2.2 不同时间水溶液引发处理

将50粒消毒后的种子完全浸没于水中，重复3次，置于25℃黑暗环境下分别引发0(CK)、24、36、48和72 h。

1.2.3 10% NaOH 溶液处理

用10% NaOH溶液分别浸种0(CK)、10、20、30、40、50 min，处理后用蒸馏水反复冲洗至pH 为7.0。

1.2.4 引发剂与10% NaOH 溶液处理

将上述试验中结果较佳处理与不同10% NaOH溶液浸种时间处理进行组合。组合处理1：先用5%KNO3对青绿苔草种子进行引发处理，再分别将其用10% NaOH 溶液浸种0(CK1：5%KNO3溶液引发)、10、20、30、40和50 min，处理后用蒸馏水反复冲洗至pH为7.0；组合处理2：先用480 mg·L−1GA3对青绿苔草种子进行引发处理，再分别将其用10%NaOH溶液浸种0(CK2：480 mg·L−1GA3溶液引发)、10、20、30、40和50 min，处理后用蒸馏水反复冲洗至pH 为7.0；组合处理3：用10% NaOH 溶液分别浸种0 (CK3：5%KNO3溶液引发)、10、20、30、40和50 min，处理后用蒸馏水反复冲洗至pH为7.0后，再用5%KNO3引发；组合处理4：用10% NaOH 溶液分 别 浸 种0 (CK4：480 mg·L−1GA3溶 液 引 发)、10、20、30、40和50 min，处理后用蒸馏水反复冲洗至pH 为7.0后，再用480 mg·L−1GA3引发；组合处理5：先用5%KNO3对青绿苔草种子进行引发，后将其用10% NaOH 溶液分别浸种0(CK5：5%KNO3溶液引发后，480 mg·L−1GA3溶液再引发)、10、20、30、40和50 min，浸种后用蒸馏水将种子反复冲洗至pH 为7.0，最后用480 mg·L−1GA3再将种子进行分别引发。

1.3 测定指标

种子发芽势= 初期(第5天)发芽种子数/供试种子数×100%；

种子发芽率= 终期(第15天)发芽种子数/供试种子数×100%；

式中：n为在时间t时，新发芽的种子数，t为发芽时间。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件分别对不同引发剂不同浓度处理及水引发处理进行单因素方差分析，用平均值± 标准误表示测定结果，对10% NaOH 处理及引发与碱处理采用Excel 2019制图，并用Duncan 法对各测定数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度引发剂对青绿苔草种子发芽的影响

不同引发剂及其浓度对青绿苔草种子的影响不同(表1)。不同浓度PEG溶液能够影响青绿苔草种子的发芽，发芽势、发芽率、发芽指数均随着PEG 浓度的升高呈先升高后降低的趋势，平均发芽时间呈先降低后升高的趋势。发芽势在5%PEG 引发处理下达到最大值(3%)；发芽率在15%PEG引发处理下达到最大值(97%)，显著高于对照以及浓度20%和25%的两个处理(P<0.05)；PEG 浓度为5%时发芽指数达最大值(6.31)，与10%和15%的两个处理间无显著差异(P>0.05)，但显著高于对照以及20%和25%的处理；PEG浓度为5%时平均发芽时间最短，为7.87 d，显著低于对照，但与其他处理间无显著差异。

表1 不同浓度引发剂下青绿苔草种子的发芽指标Table 1 Germination indicators of C.leucochlora seeds primed with different concentrations of priming solution

不同浓度CaCl2引发处理能提高种子的发芽势，但各处理间差异不显著(P>0.05)。随着浓度的增加，发芽率整体呈上升趋势，在20 mmol·L−1CaCl2溶液引发下最高，为98%，显著高于对照(P<0.05)；不同浓度处理下青绿苔草种子的发芽指数、平均发芽时间与对照差异显著(P< 0.05)，且均在25 mmol·L−1CaCl2引发处理下分别达到最大值、最小值。

不同浓度NH4NO3处理对青绿苔草种子发芽的影响不大且无明显规律可循。与CK 相比，不同浓度NH4NO3处理的发芽势和发芽率均无显著差异(P>0.05)，NH4NO3浓度为0.04%和0.08%时发芽指数显著提高，NH4NO3浓度为0.04%平均发芽时间显著降低。

青绿苔草种子的发芽与KNO3浓度有关，随着浓度增加，种子发芽势、发芽率及发芽指数逐渐降低，平均发芽时间逐渐增长。在5%KNO3处理下，种子发芽势、发芽率、发芽指数均为最大值，显著高于对照组(P<0.05)，分别为11%、97%、7.37，比对照分别提高11%、4%、2.06；平均发芽时间最短，显著低于对照(P<0.05)，提前2.11 d 发芽；当浓度高于20%时，发芽率、发芽指数和平均发芽时间均低于对照组。

随着GA3浓度的增加，种子的发芽势、发芽率和发芽指数先升高再降低，平均发芽时间先缩短再增长，呈现出低浓度促进、高浓度抑制的特征。低浓度的GA3处理能显著提高种子的发芽势，在480 mg·L−1GA3浓度下达到最大值，为32%，比对照提高32%；GA3对种子发芽率影响不大，各处理与对照组差异不显著(P>0.05)，但在480 mg·L−1GA3处理下达到最大值，高出对照4%；在不同处理下，种子发芽指数和平均发芽时间与对照相比差异显著(P<0.05)，在480 mg·L−1GA3处理下发芽指数达到最大值8.00，比对照高2.69，平均发芽时间在240 mg·L−1GA3处理下最短，为6.12 d，比对照提前2.89 d，但与480 mg·L−1GA3处理下的平均发芽时间差异不显著(P> 0.05)。

2.2 不同时间水引发对青绿苔草种子发芽的影响

不同时间的水浸种处理能提高种子的发芽势、发芽指数，缩短发芽时间，但会降低种子的发芽率(表2)。种子的发芽势、发芽指数分别在水引发48 h、36 h 达到最大值，且显著高于对照(P<0.05)，分别为16%和6.23，比对照分别提高16%和0.92；平均发芽时间在引发72 h 时降到最低值，为6.89 d，比对照快2.12 d。

表2 不同时间水引发下青绿苔草种子的发芽指标Table 2 Germination indicators of C.leucochlora seeds primed with water priming for different times

综上，5%KNO3以及480 mg·L−1GA3对青绿苔草种子的引发效果最佳，两种处理下种子发芽指数分别比对照高2.06和2.69，分别为7.37和8.00，平均发芽时间分别为6.90和6.29 d，比对照分别缩短2.11和2.72 d，因此，这两种引发方法可以有效解决青绿苔草种子发芽慢的问题，为下一步的混合处理提供参考。

2.3 10%NaOH浸种时间对青绿苔草种子发芽的影响

随着NaOH 浸种时间的增长，青绿苔草种子的发芽率、发芽势和发芽指数均呈逐渐增加的趋势，平均发芽时间呈逐渐缩短的趋势(图1)。当NaOH浸种时间为50 min 时，发芽势、发芽率及发芽指数均达到最大，分别为54%、98%、8.86，比对照提高54%、5%、3.55；平均发芽时间达到最小值5.69 d，比对照提前3.32 d。

图1 不同10%NaOH 溶液浸种时间下青绿苔草种子的发芽指标Figure 1 Germination indicators of C.leucochlora seeds soaked in 10%NaOH solution for different times

2.4 组合处理中不同10%NaOH 浸种时间对青绿苔草种子发芽的影响

组合处理1中，随着10% NaOH 溶液浸种时间的增加，其发芽势、发芽率及发芽指数先升高后降低，平均发芽时间先缩短后增长(图2A、图2B)；浸种40 min 时，发芽势、发芽指数达到最大，分别为92%和11.03，平均发芽时间降到最低，为4.53 d；发芽率在浸种30 min 时达到最高，为100%。组合处理2中不同浸种时间对其各发芽指标也均有一定程度的影响(图2C、图2D)，随着时间的增加，发芽势和发芽指数呈现先升高后降低的趋势；发芽势与发芽率在浸种30 min 时达到最大，分别为80%和99%；发芽指数在浸种40 min 时达到最大，为10.60；平均发芽时间随着处理时间的增加先缩短后增长，在浸种40 min 时发芽所需时间最短，为4.63 d。因此青绿苔草种子在组合处理1中效果较佳，且在浸种30～40 min 时能够达到较好的发芽效果，明显提高种子的发芽势、发芽指数，缩短种子发芽时间。

图2 组合处理1和组合处理2不同10%NaOH 溶液浸种时间下青绿苔草种子的发芽指标Figure 2 Germination indicators of C.leucochlora seeds under different soaking times of 10%NaOH solution in combination treatment 1 and combination treatment 2

组合处理3中，种子的发芽指标因浸种时间不同而发生明显变化(图3A、图3B)，随着处理时间的增加，种子的发芽状况会减弱，其发芽势、发芽率及发芽指数整体呈现先升高后降低的趋势，在浸种20、10和10 min 时达到最高，分别为45%、95%和8.31，平均发芽时间在浸种10 min 时最短，为6.04 d。组合处理4中发芽势、发芽率及发芽指数均在NaOH浸种20 min 下达到最高(图3C、图3D)，分别为60%、97%、9.29，平均发芽时间在此处理下降到最低，为5.43 d，其整体发芽趋势与NaOH 处理后5% KNO3引发的趋势基本一致，同样在长时间的NaOH处理下会抑制种子的发芽。所以，在NaOH 处理的基础上，用GA3引发要比KNO3引发的发芽效果好。

图3 组合处理3和组合处理4不同10%NaOH 溶液浸种时间下青绿苔草种子的发芽指标Figure 3 Germination indicators of C.leucochlora seeds under different soaking times of 10%NaOH solution in combination treatment 3 and combination treatment 4

对青绿苔草种子进行多次引发与不同时间10%NaOH浸种会对种子的发芽指标产生不同影响(图4)。随着NaOH 浸种时间的增加，种子的发芽势、发芽率及发芽指数先增加后降低，平均发芽时间先缩短后增长，发芽势、发芽指数及平均发芽时间在NaOH浸种20 min 时达到最佳，分别为92%、11.23、4.46 d，发芽率在NaOH处理10 min 时达到最高，为99%，结果表明，该处理能够明显改善种子的发芽状况，组合处理5即先用5% KNO3引发，再用10% NaOH浸种10～20 min，最后用480 mg·L−1GA3引发是本研究中处理青绿苔草种子促使其发芽指数升高、平均发芽时间提前的最佳方案。

图4 组合处理5不同NaOH 溶液浸种时间下青绿苔草种子的发芽指标Figure 4 Germination indicatorsof C.leucochlora seeds under different soaking timesof 10%NaOH solution in combination treatment 5

3 讨论与结论

种子引发能弱化种子内部胚根周围的限制组织，进而增加细胞弹性来促进胚根的生长，进而显著提高种子出苗速度[20-22]。植物常处于不利环境，非生物逆境胁迫会影响种子发芽，通过引发可激发种子的细胞防御响应，达到发芽快的效果[23]。不同引发处理均能在一定程度上促进种子发芽，但其效果受引发剂种类和浓度影响。在渗透引发中，低浓度的PEG 对膜损伤有修复作用，或通过降低ABA含量改变种子内部激素间配比以促进胚生长[24-25]；氮预处理可使种子内部与发芽相关的多种酶活性被激活以及自由基提高，有效缓解活性氧大量累积对细胞结构与功能造成的损伤来加快发芽速率[26]，这可能也是低浓度NH4NO3促进苔草种子发芽的原因。低浓度KNO3溶液可使种子在吸湿阶段进行一系列修复活动，减少种子劣变来提高活力[27]；种子经CaCl2引发后钙离子可能会浸入种子内部，胚乳细胞或扩大的胚根细胞内钙浓度会随之增加，进而导致了一种或者更多钙离子结合调节蛋白活化，其会依次激活与发芽代谢的关键酶，从而促进发芽[28]。本研究发现15% PEG 能显著提高青绿苔草种子的发芽率，低浓度(0～0.08%)的NH4NO3、(5%～10%)的KNO3及高浓度(25%)的CaCl2均能有效提高青绿苔草种子的发芽指数，缩短平均发芽时间，与夏枯草(Prunella vugaris)[29]、碱茅(Puccinellia distans)[30]、西瓜(Citrullus lanatus)[31]、荞麦(Fagopyrum esculentum)[27]的研究结果一致。随着GA3浓度增加，青绿苔草种子的发芽势、发芽率及发芽指数先升高后降低，表现出低浓度促进高浓度抑制的特征，这与野生茄子(Solanum coagulans)[32]的研究结果基本一致，可能是因为GA3浸种后，种皮蜡质层被腐蚀，细胞膜被修复，改变其离子通透性，提高种子胚内酶的活性，增强生理生化过程与呼吸作用，促进特定基因表达来提高种子发芽势及发芽率[33-35]，但GA3浸种浓度过高时，种子浸出液的电导率偏高，从而抑制种子的发芽[36]。水引发通过控制给水条件，种子可定量吸水，损伤的细胞膜有充分时间进行修复和重组[37]，改变和调控种子内部的生理生化活动与过程，进而促进了种子胚根生长[38-39]，但长时间的水引发会使死细胞核的百分率增加，从而抑制种子发芽，使发芽率降低[40]。本研究中不同时间水引发降低了青绿苔草种子的发芽率，但发芽指数明显提高，发芽时间提前，与闵丹丹等[41]在紫花苜蓿(Medicago sativa)种子上的研究结果一致。本研究中PEG-6000、CaCl2、NH4NO3、水引发均能在一定程度上提高青绿苔草种子的发芽指数，缩短平均发芽时间，但其引发效果不如KNO3、GA3好，其中以5% KNO3和480 mg·L−1GA3效果最佳，这可能因种子自身特性，不同引发剂、不同浓度对种子发芽的影响不同。引发过程中引发温度、引发时间及回干时间均会对引发结果产生极大的影响[42]。

NaOH 具有去除抑制物、软化种皮等多种作用，能够促进种子的发芽[43]。本研究通过10% NaOH 不同浸种时间与引发处理相结合的方法对青绿苔草种子进行组合处理，并取得了一定的效果，通过50 min浸种，青绿苔草种子的发芽势、发芽率、发芽指数分别达到54%、98%、8.86，平均发芽时间缩短至5.69 d。但浸种后未进行后续处理，不利于种子的储存，因此基于引发的基础，考虑碱处理与引发相结合是否会得到更好的处理方案来解决青绿苔草种子的实际应用以及种子生产化的问题。本研究通过10%NaOH不同时间浸种与引发处理相结合发现，组合处理1 (先用5%KNO3引发，再用10% NaOH 处理)浸种40 min 效果最佳，发芽势、发芽率、发芽指数分别高达92%、98%、11.03，平均发芽时间也缩短至4.53 d，这可能是在先引发过程中种子内部发生生理生化代谢、相关酶活化以及特定基因开始表达，在此基础上经过碱处理后，种子内部的抑制物可能被去除，进而促进胚的生长，加快种子的发芽。但由于先引发再经10% NaOH 处理并不利于处理后种子的储存，考虑在此基础上再次进行引发是否会得到更好的方案且解决此问题。研究结果表明组合处理5中即对青绿苔草种子先用5%KNO3引发，后进行10% NaOH 处理20 min，再进行480 mg·L−1GA3引发，可使青绿苔草种子的发芽势、发芽率、发芽指数分别提高至92%、98%、11.23，平均发芽时间提前至4.46 d，经过再次引发，本研究发芽指标并没有发生显著改变，或许影响后期幼苗的生长状况，这将是下一步研究的领域，但此方案实现了青绿苔草种子一周内出苗的可能，有效解决了青绿苔草种子发芽慢的问题。

综上所述，5% KNO3、480 mg·L−1GA3、10% NaOH处理青绿苔草种子，均可显著提高发芽势和发芽指数，进而缩短发芽时间。三者组合处理(先用5% KNO3引发，后用10% NaOH 浸种20 min，再用480 mg·L−1GA3引发)的效果更好，与未经任何处理的青绿苔草种子相比，发芽势为92%、发芽指数提高5.92、发芽率从93%提高到98%、平均发芽时间缩短4.55 d，这是一种解决青绿苔草种子出苗慢的有效方法，同时可利于青绿苔草种子的生产化，打开其在园林绿化草坪地被应用中的广阔前景。