桔梗汤协同增强消癌平口服液抗肺癌作用研究

李国峰，张武岗，郭莹帆，蔡锦洪，梁新丽*，陈海芳*

（1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006； 2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004）

消癌平口服液是由通关藤药材精制提取而成的中药单方制剂。研究表明，消癌平对食管癌［1］、胃癌［2］以及肺癌［3］等癌症有抗癌活性。然而在临床应用中，消癌平常与一线化疗药物顺铂［4］、吉非替尼［5］、紫杉醇［6］等联合应用居多，单独用于抗癌治疗较少。其原因可能与其所含药效成分甾体皂苷类，生物利用度低有关。将引经药与化疗药合用，即“引经化疗”［7］，拟通过提高治疗药物靶区的药物浓度，进而提升药物化疗效果，是当前恶性肿瘤治疗中的一条新途径、新方法。研究证实，许多引经药物包括冰片、川芎等引经药物可促进抗肿瘤药物顺铂、甲氨蝶呤和替莫唑胺在病变区的分布［8⁃10］。那么，是否可通过配伍引经药促进消癌平提升抗癌药效则是本文的研究目的。

桔梗汤出自《金匮要略》，由桔梗、甘草二味药组成，是治疗肺痈的有效处方。同时，李时珍在《本草纲目》 中指出，桔梗为肺部引经药，与甘草同行，可做舟楫之剂［11］。前人研究桔梗汤中的成分桔梗配伍化疗药可起到引经增效作用。李扬等［12］发现桔梗可增加顺铂原位肺癌移植瘤裸鼠体内的分布，提升顺铂抗癌作用。桔梗配伍乳移平可能通过调节CXCL12／CXCR4 生物学轴及癌基因HER⁃2 抑制乳腺癌肺转移的发生、发展［13］。本研究基于lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，考察消癌平口服液配伍桔梗汤前后对荷瘤小鼠体质量变化、小鼠外周血常规、小鼠血清中IL⁃2、IL⁃10 的含量以及肿瘤体积和抑瘤率的影响，以期阐明桔梗汤配伍消癌平的解毒增效作用机制。

1 材料

1.1 仪器 酶标仪（美国Thermo 公司）；压力蒸汽灭菌锅（上海申安医好器械厂，型号LDZX⁃30KBS）；低速离心机（上海飞鸽股份有限公司，型号800B）；超净工作台［日本Sanyo 公司，型号MCV⁃B161S⁃（T）］；二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司）；显微镜（德国Leika 公司，型号DMI3000B）；小动物血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BC⁃2800vet）；血球仪（瑞士Swelab公司，型号Autocounter 900＋）；3⁃18K 型高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）。

1.2 药物与试剂 消癌平口服液（湖北凤凰白云山药业有限公司，国药准字Z20060319）；桔梗饮片（安徽济善堂中药科技有限公司，批号20170518）；甘草饮片（江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，批号20170427）。DMEM 高糖培养基（美国HyClone 公司）；胎牛血清（FBS）（美国Gemine 公司）；青链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶（美国Genview 公司，批号20170327）；小鼠IL⁃2 ELISA 试剂盒（批号A202H90532），小鼠IL⁃10 ELISA 试剂盒（批号A210904141）。

1.3 动物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 级，体质量（20±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物生产许可证号SCXK（湘）2016⁃0002］。

1.4 细胞株 Lewis 肺癌细胞株购自美国ATCC 细胞库，编号36470TM。

2 方法

2.1 桔梗汤水提液的制备 准确称取桔梗、甘草饮片各30.0 g，加入10 倍体积的双蒸水浸泡30 min 后加热煮沸，开始用强火，沸腾后改用文火，保持微沸1 h，搅拌，趁热过滤，药渣再加蒸馏水同法煮沸后1 h，滤过。合并滤液，经浓缩，最后用双蒸水定容至250 mL 容量瓶中，密封，放置4 ℃冰箱保存，备用。

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型的制备 取所培养的处于对数生长期Lewis 肺癌细胞，PBS 清洗2 次后，加胰蛋白酶2 mL消化后终止，1 000 r／min 离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的高糖培养基吹打细胞制成细胞悬液，细胞计数后，用DMEM 高糖培养基配制成浓度为5×106／mL的单细胞悬液备用。每只C57BL／6 小鼠右前肢腋下皮下注射0.2 mL 细胞悬液构建Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。注射后的C57BL／6 小鼠继续按正常情况饲养，每天观察小鼠接种后的生活状态及皮下出瘤情况。

2.3 分组及给药 接种10 d 左右，注射部位可见皮下肿瘤，肿瘤外观近似圆形或椭圆形，选取肿瘤直径为2～3 mm的荷瘤小鼠随机分6 组，每组10 只，分别为模型组（生理盐水）、消癌平口服液组（7.8 mL／kg）、低剂量组（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋1.3 g 生药／kg 桔梗汤）、中剂量组（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋2.6 g 生药／kg 桔梗汤）、高剂量组（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋5.2 g 生药／kg 桔梗汤）、桔梗汤组（2.6 g 生药／kg 桔梗汤）。连续给药2 周。另设正常组：常规饲养。

2.4 小鼠生存状态观察 每天观察给药后小鼠的活动状态，进水饮食量，毛发色泽，有无死亡情况以及体质量变化。

2.5 瘤体积和抑瘤率测定 在给药干预期间，每隔一天用游标卡尺测量小鼠瘤径，计算瘤体积。末次给药24 h 后颈椎脱臼法处死小鼠，剥取瘤组织称重。有效率为药物抑瘤率≥60%的小鼠数量占本组小鼠总数中的比例。瘤体积V（mm3）＝a×b2／2 （a为肿瘤长径，b为肿瘤短径），抑瘤率＝ ［（模型组瘤重－给药组瘤重）／模型组瘤重］ ×100%。

2.6 小鼠脏器指数测定 末次给药24 h 后称重，采血后，小鼠脱颈椎处死，解剖并取出小鼠心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏组织并称重。脏器指数（mg／g）＝脏器质量（mg）／处死当日体质量（g）×100。

2.7 小鼠外周血常规的检测 小鼠在末次给药24 h 后，对各组C57BL／6 小鼠进行静脉眼眶取血，每只取0.2 mL置于含EDTA⁃2 K 的1.5 mL 离心管中，混匀，采用全自动血液分析仪对白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HGB）进行测定。

2.8 小鼠血清中细胞免疫因子IL⁃2 和IL⁃10 的测定 血标本凝集30 min，以1 000×g离心10 min 后吸取血清，严格按照ELISA 试剂盒步骤和方法进行操作。使用酶标仪进行双波长检测，测定在450 nm 最大吸收波长和570 nm 或630 nm参考波长下得OD。绘制出标准曲线的直线回归方程，计算出白细胞介素2（IL⁃2）、白细胞介素10（IL⁃10）水平。

2.9 统计分析 采用Graphpad Prism 5.0 软件作图并统计分析，所有数据均以（），多组间比较采用单因素方差分析（One⁃way ANOVE），P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠的生活状态 对C57BL／6 小鼠观察发现，接种后第1 周，各组小鼠活动正常，无明显变化，精神尚可，毛色无明显变化。第2 周，空白组小鼠活跃，精神尚可，毛色正常，饮水、进食量正常；模型组小鼠活动明显减弱，精神不振，饮水，进食量明显减少，毛色无光泽；消癌平组小鼠毛质较粗糙，精神一般，饮水、进食量减少，毛色无光泽；联合给药组活动减弱，精神一般，饮水、进食量减少，毛色无光泽。

3.2 桔梗汤联用前后对小鼠体重的影响 由于小鼠饲养后期肿瘤增长快速，其瘤子的变化超过体质量变化，因此，为了更准确衡量药物干预对体质量的影响，在连续给药干预两周后颈椎脱臼法处死小鼠，去除肿瘤组织后，对干预前后的小鼠称定质量，与正常组比较，模型组荷瘤小鼠体质量下降（P＜0.01），消癌平治疗后体质量上升（P＜0.05），联合桔梗汤后，联合用药组均上升（P＜0.05，P＜0.01），见图1。

图1 各组小鼠体质量变化（n＝10）

3.3 小鼠肿瘤体积及抑制率 本实验以治疗药物的抑瘤率＞60%为标准认为药物有效，本实验消癌平组抑瘤率大于60%的比例为18%，低剂量联合组和中剂量联合组抑瘤率大于60%的比例达到27%，而高剂量联合组抑瘤率大于60%的比例可达到45%，见表1。连续给药14 d 后，与模型组比较，消癌平组瘤体积并没有减小；而与桔梗汤联用后，小鼠瘤体积减少，与消癌平组或模型组相比较，高剂量组瘤体积均减小（P＜0.05），见图2，治疗结束后剥离瘤组织，见图3。该结果表明，随着桔梗汤剂量的提高，桔梗汤可明显提升消癌平药物抗肺癌作用。

表1 各种药物的抑瘤情况（n＝10）

图2 各组小鼠肿瘤体积变化（n＝10）

图3 各组小鼠肿瘤实物图

3.4 桔梗汤联用消癌平后对脏器指数的影响 由图4 可以看出，荷瘤小鼠药物前后的心、肝、肺及肾的脏器指数变化不大。然而对于脏器脾，研究发现，相比正常组，模型组荷瘤小鼠脾有一定程度肥大，但差异无统计学意义（P＞0.05）。经消癌平治疗，与正常组比较脾肥大（P＜0.01），经桔梗汤配伍后，低剂量组和中剂量组肥大趋势下降，但差异仍有统计学意义（P＜0.05），而高剂量桔梗汤与消癌平合用后，肥大现象下降趋势明显，与正常组比较无差异（P＞0.05）。

图4 各组小鼠脏器指数变化（n＝10）

3.5 桔梗汤联用消癌平后对血常规的影响 由图5 可以看出，与正常组比较，荷瘤组小鼠WBC 上升（P＜0.05），其原因可能是荷瘤小鼠免疫力下降，感染所致产生炎症。另外，与正常组小鼠比较，荷瘤组小鼠RBC 和HGB 均下降（P＜0.05，P＜0.01），消癌平组和配伍组与模型组比较，差异无统计学意义。与正常组比较，模型组小鼠PLT 有下降趋势，但是差异并无统计学意义，但经消癌平治疗后，PLT 下降（P＜0.05）。而当消癌平与桔梗汤联用后，与消癌平组比较，低、中、高剂量组PLT 水平上升（P＜0.05）。

图5 各组小鼠血常规变化（n＝10）

3.6 桔梗汤联用消癌平后对细胞因子IL⁃2、IL⁃10 的影响 由图6 可以看出，与正常组比较，模型组IL⁃10 水平升高（P＜0.05），而且经消癌平治疗后，与正常组比较，消癌平组IL⁃10 水平升高（P＜0.01），与模型组比较有升高趋势。而桔梗汤与消癌平配伍合用后，与模型组比较，中、高剂量组IL⁃10 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。与消癌平组比较，不同剂量联用组IL⁃10 水平均降低（P＜0.01）。另外桔梗汤单独使用小鼠的IL⁃10 水平与模型组比较降低（P＜0.05），较消癌平组也降低（P＜0.01），结果进一步表明，配伍组降低IL⁃10 水平可能主要与桔梗汤有关。另外，对于Il⁃2 水平来说，与正常组比较，荷瘤组相对较低，但均差异无统计学意义，桔梗汤和消癌平合用后IL⁃2 水平与消癌平或模型组比较均差异无统计学意义。

图6 各组小鼠IL⁃10、IL⁃2 水平变化（n＝10）

4 讨论

肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，当前对癌症患者最主要的治疗手段仍以手术为主，术后康复仍需以化疗及药物治疗。然而，患者术后耐受性较低，对癌症的治疗，化疗药物的治疗效果却并不尽人意，多药耐药（MDR）严重，除对病变部位作用外，还损害正常组织和免疫功能，预后较差，生活质量指数下降严重，究其原因主要为药物在体内分布广泛，靶向性差有关。因此，在保证其疗效情况下，提升治疗药物的靶向性并尽可能减少不良反应是当前临床研究中的重点和难点。中药的引经作用与现代制药理论的靶向作用十分类似，可通过抑制P⁃糖蛋白促进药物吸收［14⁃15］。因此，引经化疗是当前在癌症治疗过程中提出的有效治疗模式，根据肿瘤所在部位，服用相应的引经药配合治疗来增加疗效等［7］。如鼻咽肿瘤用辛夷、白芷、苍耳子引经，脑肿瘤则僵蚕、全蝎以引药入脑，肺癌用桔梗、白果，乳腺癌用瓜蒌、山慈菇，胃癌用半枝莲、白术［16］。桔梗汤不仅为舟楫之剂，亦为治肺痈之方，因此，本文推测桔梗汤有引导增强消癌平抗癌药物的抗癌作用。

机体的免疫状态跟肿瘤的发生发展有着密切的关系。脾是跟免疫密切相关的脏器，在许多研究中发现，肿瘤经化疗后存在脾肥大问题［17⁃18］。而本实验中发现Lewis 肺癌荷瘤组小鼠普遍存在脾脏肥大现象，在模型组中荷瘤小鼠脾肥大趋势，且经消癌平治疗后肥大现象加剧，但是与桔梗汤联合后脾肥大现象减轻。另外，辅助性T 细胞（Helper T cells，Th）对机体的特异性和非特异性免疫均具有重要调节作用，其分泌的细胞因子是抗肿瘤、促肿瘤的各环节的重要“信使”。Th 细胞主要分为Th1、Th2 两种细胞，其中Th1 细胞参与细胞免疫，其分泌IL⁃2、IFN⁃γ 介导细胞免疫，主要发挥免疫防御作用；Th2 细胞分泌的IL⁃4、IL⁃10 介导体液免疫，在多种细胞组织中具有免疫刺激功效及免疫抑制作用，其中IL⁃10 通常在癌患者中呈高表达［19⁃20］。正常情况下，Th1 ／Th2 细胞因子处于动态平衡，共同调节机体免疫。因此，在癌症治疗过程中，维持Th1／Th2 细胞因子比例增加有利于肿瘤患者的恢复。而中药在肿瘤治疗通过维持Th1／Th2 平衡发挥着免疫调控作用［21⁃22］。本实验中发现，荷瘤小鼠IL⁃2 水平有下降趋势，但IL⁃2 水平整体上与正常组比较无明显差异，而IL⁃10 的水平却显著升高。桔梗汤有提升IL⁃2 的作用趋势，但是与荷瘤组比较，IL⁃2 水平差异不大；而桔梗汤与消癌平联用后，IL⁃10 水平却显著降低，这表明桔梗汤可能通过抑制IL⁃10 水平维持Th1 和Th2 的平衡，从而抑制肿瘤生长，减少转移。

肿瘤相关性贫血（cancer related anemia，CRA）为恶性肿瘤常见并发症，约有30%～90% 的患者会出现贫血，且与肿瘤恶性程度、类型及治疗方案有密切关系［23⁃24］。CRA 的发病机制较复杂，可能与肿瘤组织浸润或者放化疗药物毒副作用造成的骨髓损伤、骨髓抑制相关。由肿瘤或其治疗引起的贫血可致血液的携氧能力降低，进一步导致肿瘤缺氧，从而进一步促使肿瘤通过克隆选择和基因组改变增加恶性进展和攻击性［25］。因此，纠正CRA 和PLT 减少，提升患者的生活质量是当前肿瘤临床工作的重要工作。中西医合用已经证实可以缓解药物化疗所带来的副作用，提升病人的幸福指数。本实验中，与正常组比较，荷瘤组小鼠整个造血功能和免疫功能发生了变化，有红细胞生成不足、血红蛋白偏低以及血小板降低等营养不良现象。这种现象提示可能与肿瘤细胞侵犯骨髓有关，从而正常的造血组织被替代，导致红细胞生成不足、血红蛋白偏低以及血小板生成减少等现象。另外本实验中发现，化疗药物消癌平可进一步加剧PLT 的下降，而桔梗汤的联合，尽管对RBC、HGB 水平仅有提升趋势，但是却显著提升了PLT 的水平，改善了消癌平化疗后产生的血小板减少的症状，表明桔梗汤可能协同消癌平提升免疫力作用进而增强消癌平的抗肺癌作用。然而，桔梗汤是否也通过引经提升消癌平药效成分的血药浓度进而增强抗肺癌作用仍需实验进一步确认。