曲酸处理对娃娃菜采后褐变的影响

曾诗娴，赵孝玲，左进华，闫志成，史君彦，王 清,*，崔京春，隋 媛

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；2.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600；3.重庆文理学院园林与生命科学学院，重庆 402160）

娃娃菜（Brassica oleraceavar.bullata），属十字花科芸薹属白菜亚种，生长周期短、帮薄甜嫩、味道甘甜。娃娃菜营养价值较高，含有丰富的纤维素、维生素及微量元素，其中钙、钾含量是白菜的2～3 倍[1]，深受消费者喜爱。娃娃菜采后代谢旺盛，营养物质损耗快，修整加工过程会造成损伤胁迫，加速娃娃菜切茎褐变，导致其品质和商品价值降低[2]。因此，采用有效的保鲜方法抑制娃娃菜茎部褐变，对延长其货架期及提高经济效益具有重要意义。目前抑制娃娃菜褐变的方法主要是使用二氧化硫、亚硝酸盐和抗坏血酸等化学抑制剂。二氧化硫能够通过其强还原性抑制褐变，但二氧化硫会在食品中残留，可能会诱发过敏和哮喘[3]。亚硝酸盐主要是通过抑制酶活性来延缓褐变，但亚硝酸盐可能具有致癌性，会破坏组织维生素，并产生恶臭味。抗坏血酸是通过自身氧化以导致缺氧条件，其在含氧量高的组织或包装中作用不大[4]。

曲酸是一种由好氧微生物发酵产生的有机酸[5]，具有抗氧化作用，对多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性具有抑制作用[6]；相同浓度条件下，曲酸对PPO活性的抑制效果优于抗坏血酸和植酸[3]。曲酸易溶于水，并具有抗菌能力强、热稳定性高、pH值适应范围广、对人体刺激性小等优点[7]。曲酸具有的独特性质使其成为非常有潜力的果蔬保鲜剂。王擎等[8]发现用质量分数0.3%和0.5%曲酸可将马铃薯片与莲藕片的货架期分别延长2～4 d和4～6 d。曲酸可应用于防止苹果汁褐变[9]，还可用于鲜切山药[10]及荔枝[11]的保鲜。Yan Zhicheng等[12]发现用曲酸和CaCl2复合处理西兰花能有效延缓西兰花黄化和异味的产生。张婷婷等[13]发现曲酸对鲜切苹果褐变的抑制作用优于柠檬酸和抗坏血酸，曲酸可作为鲜切苹果的保鲜剂和护色剂。目前研究较多的是曲酸与其他物质组成的复合保鲜剂对果蔬的保鲜效果[14-16]，以及曲酸的抑菌效果[17]，鲜有曲酸抑制娃娃菜茎部褐变的研究。本实验研究了曲酸处理对抑制娃娃菜茎部切口褐变的影响，以期为娃娃菜贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘京春娃3号’娃娃菜采摘于北京市农业发展有限公司顺义农场，采收后2 h内运送至实验室，选择大小一致且无烂叶、无萎蔫的新鲜娃娃菜作为实验材料。

聚乙烯（polyethylene，PE）膜（40 cm×30 cm，厚度0.03 mm） 北京华盾雪花有限公司；浓盐酸、甲醇、乙酸、无水乙酸钠、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、PVP-40、Triton X-100、愈创木酚 西陇化工有限公司；30%过氧化氢溶液、Na2HPO4、NaH2PO4国药集团化学试剂有限公司；曲酸、邻苯二酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、NaOH、硼酸、硼酸钠、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巯基乙醇、L-苯丙氨酸 北京科创欣达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司；TGL-16G-A高速冷冻离心机 广州晟龙实验仪器有限公司；7820A气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；CR-400色度计 日本Konica Minolta公司；GXH-3052L型便携式红外线气体分析器 北京均方理化科技研究所；All Basic分析研磨机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 娃娃菜处理

去除娃娃菜茎部表层约1 mm后将其随机平均分为2 组，每组24 袋，每袋3 颗娃娃菜。将娃娃菜茎部在超纯水（对照）或0.05 g/L曲酸溶液中浸泡1 min，取出晾干水分后装入PE袋（折口不密封），再将其于20 ℃、相对湿度90%冷库中贮藏5 d，每天取样测定相关指标。

1.3.2 感官评价

参照SB/T 10879—2012《大白菜流通规范》[18]以及King等[19]的方法，根据娃娃菜茎部横切面的外观色泽、新鲜度、颜色均匀度以及整棵娃娃菜的完整性进行评分，评分标准见表1。

表1 娃娃菜的感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of baby cabbages

1.3.3 茎部褐变指数测定

褐变指数测定参考虎云青等[20]的方法。按照娃娃菜茎部横切面的褐变面积评级：0级，无褐变；1级，褐变面积比例≤5%；2级，5%＜褐变面积比例≤10%；3级，10%＜褐变面积比例≤30%；4级，30%＜褐变面积比例≤60%；5级，褐变面积比例＞60%。茎部褐变指数按式（1）计算。

1.3.4 茎部色泽测定

采用色差仪测定娃娃菜的L*值、a*值、b*值。选取娃娃菜茎部横切面任意1/3面积测定，重复3 次。

1.3.5 质量损失率测定

采用差量法测定质量损失率，具体按公式（2）计算。

1.3.6 呼吸强度测定

呼吸强度采用气流法[21]测定，将样品从保鲜袋中取出，置入样品所在库中的呼吸罐，采用气体分析仪测定呼吸罐中的CO2浓度，测定时长为30 min，每次测定结束后放回原处继续贮藏，以备继续测定。以每千克鲜质量样品每小时产生的CO2质量定义为呼吸强度，单位为mg/（kg·h）。

1.3.7 乙烯释放速率测定

乙烯释放速率测定参照曹建康等[22]的方法。将专用于测定乙烯释放速率的娃娃菜放于塑料筐中用保鲜膜密封1 h，用气相微量进样器抽取1 000 μL气体，利用气相色谱仪测定乙烯体积分数，并以每千克鲜质量样品每小时释放的乙烯体积定义为乙烯释放速率，单位为μL/（kg·h）。

1.3.8 总酚、类黄酮含量测定

总酚、类黄酮含量采用曹建康等[22]的比色法测定。以每克样品在280、325 nm波长处的光密度值分别表示总酚、类黄酮含量。

1.3.9 丙二醛含量测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法[22]。切取1 cm厚的娃娃菜茎部作为样品，并用分析研磨机将样品磨成粉末。取磨样后的娃娃菜组织1 g，准确量取5 mL 100 g/L的三氯乙酸与娃娃菜样品均匀混合，然后4 ℃、13 000×g离心20 min，将2 mL上清液与2 mL 5 g/L的硫代巴比妥酸混合煮沸30 min，冷却后测定混合液于450、532 nm和600 nm波长处的吸光度，实验重复3 次。

1.3.10 苯丙氨酸解氨酶活力测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活力测定参考静玮等[23]的方法，取1.3.9节中研磨后的样品1.0 g与5.0 mL 0.1 mol/L pH 8.8的硼酸-硼砂缓冲液（每100 mL含3 g PVP、0.037 g乙二胺四乙酸钠盐和0.137 mLβ-巯基乙醇，下同）混合，4 ℃、15 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液。反应体系包括0.1 mL粗酶液、3.9 mL硼酸-硼砂缓冲液和1.0 mL 0.6 mmol/LL-苯丙氨酸溶液，对照以0.1 mL蒸馏水代替0.1 mL粗酶液。将反应液置于37 ℃恒温水浴中保温1 h后测定290 nm波长处的吸光度，以吸光度每小时变化0.01所需酶量为1 个PAL活力单位（U），结果以组织鲜质量计，单位为U/g。

1.3.11 PPO、过氧化物酶、过氧化氢酶活力测定

PPO、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定均参考曹建康等[22]的方法。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.5软件作图，实验结果取3 次测定平均值，利用SPSS 19.0软件对数据进行差异显著性检验（Duncan法）及皮尔逊相关性分析，P＜0.05、P＜0.01分别表示差异显著、极显著。使用HemI软件制作热图。

2 结果与分析

2.1 曲酸处理对娃娃菜外观品质的影响

感官评分能直观体现娃娃菜的商品价值。由图1A可知，娃娃菜的感官评分在整个贮藏期间呈下降趋势，其中曲酸处理组感官评分一直高于对照组，且2 d后组间呈极显著差异（P＜0.01）。由此表明，曲酸处理可明显提高娃娃菜的外观品质。由图1B可知，娃娃菜的褐变指数在整个贮藏期间呈上升趋势。曲酸处理组的褐变指数在3～5 d显著低于对照组（P＜0.05）。说明0.05 g/L曲酸处理能有效抑制娃娃菜在贮藏后期的切茎褐变。

图1 曲酸处理对娃娃菜感官评分（A）和褐变指数（B）的影响Fig.1 Effect of kojic acid treatment on sensory evaluation (A) and browning index (B) of baby cabbages

2.2 曲酸处理对娃娃菜色泽的影响

L*值表示亮度，L*值越接近100，表示样品越亮。由图2A可知，在整个贮藏期间，曲酸处理组的L*值明显高于对照组，且2 d后存在显著差异（P＜0.05），表明0.05 g/L曲酸处理组娃娃菜的茎部亮度更高。a*值代表红绿度，正值代表红色，负值代表绿色。如图2B所示，两组娃娃菜茎部在贮藏过程中的a*值均呈上升趋势，在2 d后曲酸处理组a*值开始明显低于对照组，从第3天开始存在显著差异（P＜0.05）。b*值代表蓝黄度，正值为黄色，负值为蓝色。在本实验中，b*值越大，表示娃娃菜茎部切口褐变程度越深。由图2C可知，从第1天开始，曲酸处理组b*值显著低于对照组（P＜0.05），与贮藏0 d相比，曲酸处理组和对照组在贮藏第5天时b*值分别增加了34%、43%。

图2 曲酸处理对娃娃菜L*值（A）、a*值（B）、b*值（C）的影响Fig.2 Effect of kojic acid treatment on L*(A), a*(B) and b*(C) values of baby cabbages

以上结果说明0.05 g/L曲酸处理的娃娃菜茎部切口颜色变化比对照组小，褐变程度更低，与感官评分和褐变指数结果一致。

2.3 曲酸处理对娃娃菜质量损失率的影响

质量损失率常作为果蔬保鲜的一项重要考核指标[24]。由图3可知，随着贮藏时间的延长，娃娃菜的质量损失率逐渐增加，且曲酸处理组的质量损失率极显著低于对照组（P＜0.01）。可能是曲酸处理能抑制娃娃菜贮藏期间的蒸腾作用和呼吸作用，减少水分流失。

图3 曲酸处理对娃娃菜质量损失率的影响Fig.3 Effect of kojic acid treatment on mass loss percentage of baby cabbages

2.4 曲酸处理对娃娃菜呼吸强度和乙烯释放速率的影响

呼吸消耗是果蔬采后贮藏过程中质量损耗和新鲜度下降的主要原因之一。如图4A所示，在贮藏期间，两组娃娃菜呼吸强度总体均呈先上升再下降的趋势，对照组和曲酸处理组娃娃菜的呼吸强度均在贮藏的第1天达到最高峰，分别为182.56 mg/（kg·h）和155.45 mg/（kg·h）。在贮藏前3 d，曲酸处理组呼吸强度极显著低于对照组（P＜0.01）。说明曲酸处理对娃娃菜的呼吸有抑制作用。

图4 曲酸处理对娃娃菜呼吸强度（A）和乙烯释放速率（B）的影响Fig.4 Effect of kojic acid treatment on respiration intensity (A) and ethylene release rate (B) of baby cabbages

乙烯是果蔬自身生成的内源激素，能催化果实成熟，加速果实衰老；且乙烯释放速率越高，衰老程度越严重[25]。如图4B所示，对照组娃娃菜乙烯释放速率在前3 d处于上升趋势，在第3天达到最大值，为0.108 1 μL/（kg·h），随后下降，第5天时为0.084 8 μL/（kg·h）。而曲酸处理组娃娃菜乙烯释放速率在前2 d处于上升趋势，第2天达到最大值，为0.100 8 μL/（kg·h），随后下降，第5天时为0.077 7 μL/（kg·h）。对照组的乙烯释放速率最大值高于曲酸处理组，且在贮藏第3～5天，曲酸处理组的乙烯释放速率显著低于对照组。

2.5 曲酸处理对娃娃菜总酚和类黄酮含量的影响

娃娃菜茎部受到机械伤后产生大量活性氧，导致细胞结构被破坏，从而加速酶促反应[26]。酚类化合物和PPO接触后被氧化形成醌类物质，醌再进一步合成黑褐色物质，从而引起褐变[27-29]。不同果蔬中酚类物质的含量和种类差异较大，且在褐变过程中起主要作用的酚类物质各不相同。谭兴杰等[30]发现荔枝皮中含有6 种酚类化合物，其中只有一种是PPO作用底物，PPO对其他酚类物质未表现出氧化活性。如图5A所示，曲酸处理组的总酚含量在第3天达到最大值，随后逐渐下降。而对照组的总酚含量从第1天开始逐渐上升，在第5天超过曲酸处理组。在贮藏的前4 d，曲酸处理组的总酚含量明显高于对照组，且在第2～4天有显著性差异（P＜0.05、P＜0.01）。虽然曲酸处理组的总酚含量高于对照组，但是褐变程度却低于对照组，可能是因为总酚含量升高，但娃娃菜褐变被抑制，而PPO作用的底物含量没有升高。

图5 曲酸处理对娃娃菜总酚含量（A）和类黄酮含量（B）的影响Fig.5 Effect of kojic acid treatment on total phenol (A) and flavonoid (B)contents of baby cabbages

如图5B所示，在整个贮藏期中，曲酸处理组和对照组类黄酮含量总体均呈上升趋势，但曲酸处理组的类黄酮含量极显著高于对照组（P＜0.01）。曲酸处理组的类黄酮含量高于对照组，但是褐变程度却低于对照组，可能是因为类黄酮不是PPO作用的底物。

2.6 曲酸处理对娃娃菜MDA含量的影响

果蔬中膜系统的损伤是导致酶促褐变发生的一个重要条件。MDA是膜脂过氧化的主要副产物，其含量通常作为反映脂质过氧化程度的指标[31-32]。如图6所示，曲酸处理组和对照组的MDA含量呈波动变化。在贮藏的前3 d，曲酸处理组MDA含量低于对照组。贮藏结束时，对照组MDA含量为2.25 μmol/g，比此时曲酸处理组MDA含量高32.3%。

图6 曲酸处理对娃娃菜MDA含量的影响Fig.6 Effect of kojic acid treatment on MDA content of baby cabbages

2.7 曲酸处理对娃娃菜PAL活力的影响

PAL是植物次生代谢物质木质素、酚类等生物合成途径中的关键酶，切割损伤可诱导PAL活性升高[33]。如图7所示，曲酸处理的娃娃菜在贮藏期内PAL活力高于对照组，在第1、4、5天存在极显著差异（P＜0.01）。第5天曲酸处理组PAL活力比对照组高1.0%。

图7 曲酸处理对娃娃菜PAL活力的影响Fig.7 Effect of kojic acid treatment on PAL activity of baby cabbages

2.8 曲酸处理对娃娃菜PPO和POD活力的影响

PPO是果蔬发生酶促褐变的重要酶类，它能够氧化酚类成醌，引起果实褐变[34]。如图8A所示，在贮藏期内，两组的PPO活力均呈上升趋势，且曲酸处理组的PPO活力极显著低于对照组（P＜0.01）。POD在果蔬的贮藏过程中会引起其缓慢褐变[35]。如图8B所示，在贮藏的前4 d，曲酸处理组的POD活力上升并达到最大值（36.80 U/g），之后下降。而对照组POD活力在贮藏的0～2 d上升，2～3 d下降，3～5 d上升，且在第5天达到最大值（45.31 U/g）。在整个贮藏过程中，曲酸处理组POD活力明显低于对照组。贮藏结束时曲酸处理组PPO、POD活力比对照组分别低28.5%和29.7%。以上结果说明曲酸处理可显著抑制PPO、POD活性。

图8 曲酸处理对娃娃菜PPO（A）和POD（B）活力的影响Fig.8 Effect of kojic acid treatment on PPO (A) and POD (B) activity of baby cabbages

2.9 曲酸处理对娃娃菜CAT活力的影响

CAT是最主要的活性氧清除剂，它能将代谢产生的H2O2分解成氧气和水[36]，维持活性氧代谢平衡[21]。从图9可以看出，在整个贮藏期间，曲酸处理组的CAT活力始终高于对照组，除第2天外，其他时间点均存在极显著差异（P＜0.01）。第5天CAT处理组活力比对照组高12.4%。由此可知，曲酸处理能提高娃娃菜中CAT的活力，抑制H2O2对组织造成的氧化损伤，从而延缓娃娃菜茎部切口的褐变。

图9 曲酸处理对娃娃菜CAT活力的影响Fig.9 Effect of kojic acid treatment on CAT activity of baby cabbages

2.10 曲酸处理后娃娃菜各生理生化指标间相关性分析结果

由图10可知，褐变指数与呼吸强度、MDA含量、类黄酮含量、PAL活力和CAT活力呈正相关，但相关性不显著，与乙烯释放速率、总酚含量呈显著正相关（P＜0.05），与质量损失率、a*值、b*值、PPO活力和POD活力呈极显著正相关（P＜0.01），与L*值呈极显著负相关（P＜0.01），与感官评分呈极显著负相关（P＜0.01）。

图10 曲酸处理后娃娃菜各生理生化指标皮尔逊相关性矩阵Fig.10 Pearson correlation coefficient matrix among physiological and biochemical indicators of baby cabbages treated with kojic acid

3 讨 论

娃娃菜味道清甜、口感脆嫩，且含有丰富的营养成分，能够预防各种疾病。娃娃菜在采后修整加工过程中茎部受到机械损伤，导致娃娃菜茎部切口快速褐变，进一步导致娃娃菜的软化和腐烂，最终失去其原有感官及商品价值，且其呼吸作用和蒸腾作用等生理活动加剧会引起水分和营养物质的流失。因此需要寻找一种安全有效的保鲜方法。

已有研究发现，2.5%曲酸处理可有效减少鲜切西蓝花贮藏期间的水分流失，延缓可滴定酸、VC和叶绿素含量的下降，显著提高鲜切西蓝花的贮藏品质[37]。0.5%和1%曲酸通过在油菜表面形成保护膜起到抑制叶绿素降解的作用，同时可以减缓蒸腾失水，延缓叶绿素的降解，从而延缓油菜黄化[38]。

本研究发现，与对照相比，0.05 g/L曲酸溶液处理可以有效降低娃娃菜采后呼吸速率和乙烯释放速率；且曲酸处理能有效抑制PPO和POD活力，延缓娃娃菜茎部切口褐变的发生。其主要原因可能是曲酸结构与酚类底物结构相似，可与PPO发挥活性所需的铜离子螯合，从而抑制黑色素的形成[39]。曲酸处理后娃娃菜总酚含量较高，可能是因为PPO对娃娃菜中所含的酚类物质不表现出活性，也可能是由于曲酸处理抑制了POD和PPO活力，延缓了酚类物质的氧化，减少了酚类向醌类物质的转化。0.05 g/L曲酸溶液还能有效提高抗氧化酶PAL和CAT活力，使得细胞内大量活性氧被及时清除，防止膜过氧化、功能结构被破坏，维持细胞内部的动态平衡，使娃娃菜具有更好的贮藏品质，延长其贮藏时间。

综上，使用0.05 g/L曲酸溶液处理娃娃菜茎部切口，可有效保持娃娃菜的感官品质，抑制茎部切口褐变，降低质量损失率、呼吸强度和乙烯释放速率，并减少MDA含量，提高类黄酮及总酚含量；还能降低娃娃菜的POD、PPO活力，提高PAL、CAT活力。因此，0.05 g/L曲酸处理能够有效抑制娃娃菜茎部褐变，增强娃娃菜的抗氧化能力，延长娃娃菜的货架期。