大体积固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定地表水中的五氯酚

杨 霄，李小玲，刘伶俐，洪 波，万译文

(1.湖南省水产科学研究所，中国 长沙 410153；2.农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，中国 长沙 410153)

五氯酚(pentachlorophenol，简称PCP，分子式C6HCl5O)，是一种氯代芳香族有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的毒副作用，曾作为除草剂、杀菌剂、防腐剂及生物杀灭剂等在工农业生产中广泛运用[1,2]。五氯酚化学性质稳定，在环境中易残留、难降解，可通过生物富集进入生物链；五氯酚的钠盐易溶于水，在水体中可广泛扩散，从而造成环境污染和生物蓄积[3,4]。由于毒性大、难降解及污染面广，五氯酚已经被中国等诸多国家列为优先污染物黑名单[5]。我国地表水环境质量标准 (GB 3838)中规定五氯酚的限量值为0.009 mg·L-1。开发简单、快速及灵敏的五氯酚检测方法对于环境监测和污染物治理具有重要意义。目前，五氯酚的测定方法主要为气相色谱法(GC)[6,7]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[8,9]、高效液相色谱法(HPLC)[10,11]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[12,13]以及电化学分析法[14,15]等，其中HPLC-MS/MS灵敏度高、选择性好，且不需要繁杂的衍生操作，具有广泛的适用性。地表水中的五氯酚含量通常为痕量或超痕量水平，研究者多采用固相萃取小柱(规格为3 mL或6 mL)萃取富集大体积的水样(取样量为500 mL或1 000 mL)，以实现目标物高倍数富集和预分离[7,11，12]。

固相萃取(solid-phase extraction，SPE)，是一种用于水样或其他液体样品中对目标组分具有富集和净化作用的经典前处理技术[16]。与液液萃取相比，SPE具有易于操作、有机试剂用量少、萃取回收率高等优点。但在实际应用中，固相萃取技术也存在一定的局限性。由于地表水中五氯酚含量较低，需要增大上样量进行大体积固相萃取，以实现五氯酚的灵敏可靠检测。然而传统的固相萃取技术一般适用于小体积萃取，对于大体积水样，已有的研究报道主要采用以下两种方式进行固相萃取：(1)采用大体积样品采样器进行固相萃取的上样过程，但需购置专门的设备，费用昂贵；(2)反复多次向固相萃取小柱内注入液体样品，但操作强度大且容易因操作不当造成样品之间的交叉污染。因此，必须针对大体积水样固相萃取的特点，制作简单可靠的萃取装置，以实现对地表水中五氯酚的高效率萃取。

本研究采用商用的固相萃取小柱、转接头以及空柱管为基本元件，设计制作一种简单、环保、低成本的大体积固相萃取装置。并以水样中五氯酚为检测对象，评价该装置的萃取富集性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access液相色谱-串联质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；漩涡混匀仪(美国SCILOGEX公司)；固相萃取仪(美国Supelco公司)；和泰实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg)、转接头(PP材质，1，3，6 mL通用)、60 mL空柱管(PP材质，内径26 mm，长度130 mm)均购自上海安谱实验科技股份有限公司。

五氯酚标准物质(100±0.13 mg·L-1，农业部环境保护科研监测所)；甲酸(LC-MS级，美国Sigma公司)；乙酸铵(HPLC级，美国Fluck公司)；甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 大体积固相萃取装置的组装

图1 大体积固相萃取装置示意图Fig. 1 Schematic illustration of the large-volume SPE device

取HLB固相萃取小柱、转接头及空柱管各一个，将其按顺序依次连接后即组装成大体积固相萃取装置(见图1)。将该装置置于固相萃取仪上即可进行批量固相萃取过程。每次实验完毕，固相萃取转接头和空柱管用中性洗涤剂清洗干净，再用水和甲醇洗涤，于室温下晾干后可反复使用。

1.3 样品前处理

水样用微孔滤膜 (0.45 μm)过滤后，取100 mL样品，用甲酸调节pH至3左右。用5 mL甲醇和5 mL水活化HLB固相萃取小柱，然后将水样分两次转移至大体积固相萃取装置中，在抽真空的情况下过柱(保持流速3 mL·min-1)。待水样全部过完后，将空柱管和转接头除去，向HLB小柱中加入5 mL水淋洗并抽干，用5 mL甲醇洗脱小柱，收集全部洗脱液，于45 ℃下氮吹至干。用1.00 mL 甲醇涡旋溶解残留物，过0.22 μm 微孔滤膜后，供HPLC-MS/MS测定。

1.4 标准曲线的绘制

根据需要，临用时准确吸取一定量的五氯酚标准溶液(100 mg·L-1)，用甲醇稀释配制成质量浓度为1.0，2.5，5.0，10.0，25.0和100.0 μg·L-1的标准工作溶液，上机测定。采用外标法定量，以被测组分的质量浓度x(μg·L-1)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，制作标准曲线。

1.5 色谱-质谱条件

1.5.1 色谱条件 Waters Atlantis C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm)；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；流速为0.3 mL·min-1；流动相A为水溶液(含2 mmol·L-1乙酸铵和0.1%(体积分数)甲酸)；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～1.0 min, 40%B； 1.0～2.0 min, 40%～100%B； 2.0～6.0 min, 100%B； 6.0～8.0 min, 100%～40%B； 8.0～10.0 min, 40%B。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源 (ESI)，选择反应监测(SRM)；喷雾电压为～3 kV；离子传输管温度为300 ℃；雾化器温度为300 ℃；鞘气压力设为40，辅助气压力设为10，碰撞气压力199.983 mPa。定量离子对为m/z264.7/264.7; 定性离子对m/z262.7/262.7，m/z266.7/266.7，m/z268.7/268.7;碰撞能量:～5 eV。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

图2 五氯酚的质谱图Fig. 2 Mass spectrum of PCP

五氯酚是一种氯代酚，其分子结构为苯环上含有1个羟基和5个氯原子，容易失去质子带负电荷，在负离子模式 ([M—H]-) 下具有高检测灵敏度。在ESI-模式下将五氯酚标准溶液 (μg·L-1)以流动注射方式注入质谱中，在一级质谱扫描条件下获得目标物化合物的分子离子([M—H]-)，优化喷雾电压、离子传输管温度、鞘气压力、辅助气压力等参数。然后采用二级质谱扫描方式获取母离子对应的各特征子离子，发现五氯酚 [M—H]-对应的特征子离子响应很低，这可能是由于 [M—H]-在质谱中很难被打碎。由于五氯酚结构中含有5个氯原子，而氯元素存在35Cl与37Cl同位素，因此五氯酚的分子离子([M—H]-)共有氯的4个同位素母离子对。选取相对强度最大的母离子对264.7/264.7作为定量离子对，次强的母离子对(262.7/262.7，266.7/266.7，268.7/268.7)作为定性离子对，确定如1.5.2节所述的质谱条件。五氯酚的质谱图如图2所示。

2.2 色谱条件

图3 不同流动相条件下五氯酚的SRM色谱图 Fig. 3 SRM chromatograms of PCP

五氯酚的 pKa为4.93，当溶液的pH<4.93时，五氯酚的电离受到抑制，主要以分子形式存在。当流动相中添加甲酸时，溶液的pH值显著降低，不仅能抑制五氯酚的电离，而且还可以减小目标物与色谱柱残留硅羟基的相互作用，从而改善色谱峰的峰形[3]。在流动相中加入乙酸铵可以提高五氯酚的离子化效率，进而增强灵敏度。本实验比较了不同色谱条件下五氯酚的SRM色谱图(如图3所示)，结果表明，流动相采用0.1%(体积分数)甲酸水溶液(含2 mmol·L-1乙酸铵)和甲醇时，五氯酚表现出最佳的灵敏度和色谱峰型。

2.3 固相萃取条件的优化

水样中有毒有害物质的含量很低，固相萃取可以对水样中目标物进行有效富集，从而提高检测灵敏度。固相萃取的条件影响目标物的萃取回收率，实验过程必须对固相萃取条件进行优化。本实验主要考察了pH值、固相萃取柱的选择、洗脱剂的选择和洗脱剂的用量对目标物萃取效率的影响。

2.3.1 水样的pH值 五氯酚的pKa为4.93，在酸性溶液中电离受到抑制，主要以分子形态存在，在中性和碱性溶液中可电离成离子形态。水样酸碱度的变化会直接影响五氯酚的分子解离和带电荷状况，进而影响后续的HLB柱固相萃取效果。在100 mL空白水样中添加0.2 mL五氯酚标准溶液(100 μg·L-1)后，涡旋混匀，得到0.20 μg·L-1的加标水样。分别用甲酸或氨水将加标水样的pH调节至1，2，3，4，5，6，7，8和9。按1.3节方法处理后上机测试分析，比较水样pH值对目标物萃取效率的影响(见表1)。从表1可以看出，过低或过高的pH值均可造成目标物的回收率降低，当pH=3时，五氯酚的回收率最高，故本实验确定pH=3为水样预处理条件。

表1 水样pH对五氯酚回收率的影响(n=3)

2.3.2 固相萃取柱的选择 本实验采用C18(500 mg，6 mL)，ENVI-Chrom(250 mg，6 mL)及HLB(200 mg，6 mL)3种固相萃取柱对五氯酚的萃取效率进行比较研究。结果如表2所示，采用HLB柱的回收率为95.6%，显著高于采用C18柱和ENVI-Chrom柱的回收率，这说明HLB柱对五氯酚的富集效果优于C18柱和ENVI-Chrom柱，因此，本实验选择HLB固相萃取柱。

表2 不同的固相萃取柱对五氯酚回收率的影响 (n=3)

为了进一步探求不同品牌的HLB固相萃取柱对五氯酚萃取效率的影响，本实验对比3个主流品牌的HLB固相萃取柱(Waters Oasis, 200 mg, 6 mL; Simon Aldrich, 150 mg, 6 mL; CNW Poly-Sery, 200 mg, 6 mL;)对0.20 μg·L-1的加标水样中目标物萃取回收率的影响(如表3所示)。结果表明，不同生产厂商的C18固相萃取柱对水样中五氯酚的萃取率没有显著差异。

表3 不同品牌的HLB固相萃取柱对五氯酚回收率的影响 (n=3)

2.3.3 洗脱剂的选择 选择合适的洗脱剂将目标物从吸附剂上洗脱下来是整个萃取过程的关键[17]。本实验考察了4种洗脱剂(甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮)对五氯酚的洗脱效果(表4)。结果表明，甲醇的洗脱效果比乙腈、二氯甲烷和丙酮更好，目标物回收率更高，因此本实验选择甲醇作为洗脱剂。

表4 不同的洗脱剂对五氯酚回收率的影响 (n=3)

图4 洗脱剂用量对五氯酚回收率的影响 (n=3)Fig. 4 Effect of amount of eluents on recovery of PCP (n=3)

2.3.4 洗脱剂的用量 洗脱剂用量少不能将目标物从固相萃取柱上洗脱下来，用量多则造成洗脱剂浪费，因此，洗脱剂的用量选择很重要。采用甲醇为洗脱剂，考察洗脱剂用量(2，3，4，5，6，7 mL)对萃取效率的影响(图4)。结果表明，当洗脱剂的用量在2～5 mL范围内增加时，五氯酚的回收率显著提高；当洗脱剂用量为5 mL时，回收率达到最大；当洗脱剂超过5 mL时，随着洗脱剂用量增大回收率变化差异不大。为了缩短氮吹时间，提高工作效率，确保回收率稳定，本实验选择5 mL甲醇作为洗脱剂。

2.4 大体积固相萃取装置萃取性能的研究

为了评价大体积固相萃取装置的萃取性能，本实验分别采用1.3节自制的大体积固相萃取装置和HLB小柱进行五氯酚的固相萃取过程。具体评价方法为：取空白水样，添加0.5 μg·L-1的五氯酚后，分成两组，每组10个样品。第一组样品采用1.3节的方法进行前处理，第二组样品将大体积固相萃取装置换成HLB小柱后按照相同的方法进行前处理。实验结果如下：第一组样品五氯酚的平均回收率为96.5%，相对标准偏差为4.16%，第二组样品五氯酚的平均回收率为94.8%，相对标准偏差为6.79%。结果表明，两组样品测定结果的回收率和相对标准偏差差异不大，表明采用大体积固相萃取装置和HLB小柱进行固相萃取时萃取性能均满足检测方法的要求。然而，与本实验开发的检测方法相比，采用HLB小柱进行固相萃取时，检测过程劳动强度更大，更繁琐耗时(单个样品约需上样20次)，不利于大批量样品的快速检测。

综上所述，本实验自制的大体积固相萃取装置，具有萃取性能佳、操作简单、劳动强度低的特点，适用于大体积水样的固相萃取。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性范围和灵敏度 按照1.4节的方法配制标准工作溶液，上机测定，制作标准曲线。在空白水样中添加低浓度的五氯酚标准溶液，按照1.3节的方法处理后上机测定，以信噪比(S/N)为3和10分别确定五氯酚的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。五氯酚的线性范围、标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表5。由表5可知，五氯酚在1～100 μg·L-1的浓度内线性关系良好，方法的检出限和定量限低，表明本方法适用于水体中五氯酚的定量分析。

表5 五氯酚的线性范围、标准曲线、相关系数、检出限和定量限

图5 池塘水样添加样品(0.5 μg·L-1)的SRM色谱图Fig. 5 SRM chromatograms of the pond water sample spiked with PCP(0.5 μg·L-1)

2.5.2 方法的回收率和精密度 选取不含五氯酚的4种类型的地表水水样作为空白样品，分别添加0.02，0.5，5.0，10.0 μg·L-1的五氯酚标准溶液，按照本方法进行回收率和精密度实验。空白水样添加回收率实验结果见表6，池塘水样添加样品(0.5 μg·L-1)的SRM色谱图见图5。从表6可以看出，五氯酚的回收率在76.5%～101.2%，相对标准偏差(RSD)均小于10%，表明该方法的回收率高，精密度好，适用于地表水中五氯酚的检测。

表6 空白水样添加回收率和方法精密度实验(n=6)

2.6 与其他方法的比较

将本实验建立的大体积固相萃取结合高效液相色谱串联质谱检测五氯酚的方法与已经报道的检测方法进行对比(见表7)可以发现，本方法具有线性范围宽、检出限低和回收率高等优点。更为重要的是，本方法固相萃取过程中水样取样量更少，单次上样量大，劳动强度更低。这表明，本实验建立的方法具有较好的应用前景，可以作为一种简便、快速、高效的检测水体中五氯酚含量的新方法。

表7 与其他检测水样中五氯酚的方法对比

2.7 实际样品检测

为了验证方法的可靠性和实用性，采用本实验优化的前处理方法和仪器条件对湖南省某市的10个池溏、5个湖泊和5个水库的水样进行检测，结果表明，池溏水样中五氯酚的质量浓度在0～1.05 μg·L-1，湖泊水样中五氯酚为0～0.27 μg·L-1，水库水样中五氯酚的质量浓度在0～0.11 μg·L-1，均未超过我国地表水环境质量标准规定的限量值0.009 mg·L-1。本方法灵敏度高，操作简单高效，适合批量测定水样中五氯酚的质量浓度，可以为分析和监测地表水中五氯酚的分布状况和污染特征提供技术支持。

3 结论

本实验以自制的大体积固相萃取装置对水样中五氯酚进行固相萃取，优化了水样的pH值、固相萃取柱的选择、洗脱剂的选择和用量等固相萃取条件，建立了一种大体积固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱测定水样中五氯酚的方法。该方法具有灵敏度高、简单、经济和高效的特点，适用于地表水中五氯酚的检测，为开发大体积水样固相萃取的新方法提供了思路。