lncRNA SNHG3 靶向调控miR-514a-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

谭晓谦 梅海波 伍江雁 严 安

湖南省儿童医院骨科，湖南长沙 410007

骨肉瘤是骨肿瘤中常见的一种恶性肿瘤，具有侵袭性极高、恶性程度高、预后不良等特点，超过15%的患者在确诊时已经发现有远处转移[1-3]。骨肉瘤的治疗主要以手术切除和手术期化疗为主，其中未发生远处转移的骨肉瘤患者的5 年生存率高达70%，但是转移性和复发性骨肉瘤患者的5 年生存率低于20%[4-5]。近年研究结果显示，长链非编码RNA 在骨肉瘤中通过参与细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和转移等生物学过程，发挥着重要的作用[6-8]。核仁小分子RNA 宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）位于人染色体1p35.3 位置上，在多种肿瘤中异常表达。研究发现SNHG3 在骨肉瘤组织中高表达，与不良预后显著相关；SNHG3 靶向作用miRNA-151a-3p 上调AB22A 表达促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移[9]。微小RNA（microRNA，miRNA）在多种肿瘤中起到抑癌或促癌的作用，miR-514a-5p 在多种癌细胞中表达下调，但miR-514a-5p 在骨肉瘤的作用机制尚不明确。因此，本研究探讨SNHG3 通过靶向调控miR-514a-5p对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移的作用，为骨肉瘤疾病的诊断、治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

成骨细胞hFOB1.19 和骨肉瘤细胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 购于中国科学院上海细胞库；胎牛血清（9735212）、DMEM 培养基（91249142）购于美国Gibco 公司；si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-514a-5p、anti-miR-NC 和anti-miR-514a-5p 购于广州瑞博生物公司；引物由上海吉玛公司设计合成；LipofectamineTM2000 转染试剂盒（10652-011）、Trizol 试剂盒（10153-023）购于美国Invitrogen 公司；荧光定量试剂盒（RR246B）、反转录试剂盒（452237152）购于大连Takara 公司；CCK-8 试剂盒（32021）购于日本同仁公司；凋亡试剂盒（C0948）购于碧云天生物研究所；c-Myc 抗体（3097T）、Bax 抗体（0265T）、MMP-2 抗体（4026T）购于美国CST 公司；Transwell 小室（3564314 13324）购于美国Corning 公司；Matrigel 基质胶（3124523）购于美国BD 公司；双荧光素酶试剂盒（D0132）购于北京索莱宝公司。

1.2 细胞培养与转染

将成骨细胞hFOB1.19 和骨肉瘤细胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 常规复苏后，进行细胞培养，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基，在37℃、5%CO2中培养。细胞的密度融合至75%～85%时，加入胰蛋白酶消化。

取对数生长期的U-2OS 细胞，根据LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书进行转染，将其分为si-NC 组（转染si-NC）、si-SNHG3 组（转染si-SNHG3）、miR-NC 组（转染miR-NC）、miR-514a-5p 组（转染miR-514a-5p）、si-SNHG3+anti-miR-NC 组（共转染si-SNHG3和anti-miR-NC）和si-SNHG3+anti-miR-514a-5p 组（共转染si-SNHG3 和anti-miR-514a-5p）。

1.3 qRT-PCR 检测细胞中SNHG3 和miR-514a-5p表达

使用Trizol 试剂盒提取各组细胞的总RNA，在紫外分光光度计检测RNA 浓度和纯度。按照反转录试剂盒反转录合成cDNA，以cDNA 为模板，通过荧光定量试剂盒进行PCR 扩增。反应条件为95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。分别以GAPDH 和U6 为内参，通过2-△△Ct法计算SNHG3 和miR-514a-5p 的表达。SNHG3 正向引物：5’-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3’，反向引物：5’-TGCTCCAAGTCTGCCAAAGA-3’；GAPDH 正向引物：5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’，反向引物：5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。miR-514a-5p正向引物：5'-TCACTACTCTGGAGAGTGACAAT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6 正向引物：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向引物：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.4 CCK-8 法检测细胞活力

离心后收集沉淀的细胞，加入磷酸盐缓冲液制备细胞悬液，接种于96 孔板中，培养48 h 后，在每孔内加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养2 h，使用酶标仪及在450 nm 波长处测量吸光值。细胞活力=实验组吸光度值/空白对照吸光度值×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组离心后收集的细胞，加入500 μL 结合缓冲液，通过凋亡试剂盒说明书，分别加入5 μL Annexin-V FITC 和PI 溶液，避光反应20 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot 检测c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达

采用BCA 法检测定量蛋白，同时取45 μg 的蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳处理后，转膜，封闭，加入相应的一抗，过夜孵育，次日加入二抗，孵育2 h 后行显影处理（化学发光液），GAPDH 作为内参，采用Image J 对蛋白条带的灰度值进行分析，计算蛋白表达。

1.7 Transwell 小室检测细胞迁移和侵袭

1.7.1 迁移实验 取各组细胞加入不含胎牛血清的DMEM 培养基内，稀释细胞浓度为2×105个/mL。在Transwell 小室上层加入100 μL 细胞悬液，下层加入500 μL 含10 %胎牛血清的DMEM 培养基，培养24 h，从培养箱中取出小室，使用棉签轻轻擦拭上层细胞，加入甲醇固定30 min，结晶紫染色10 min，显微镜下选择3 个视野拍照，观察细胞数目，计数取平均值。

1.7.2 侵袭实验 在Transwell 小室上层铺稀释Matrigel基质胶，烘干后，其余步骤同“1.7.1”项下。

1.8 双荧光素酶验证SNHG3 与miR-514a-5p 关系

Starbase 在线数据库显示SNHG3 和miR-514a-5p 存在结合位点。构建SNHG3 野生型（SNHG3 wild type，SNHG3-WT）和SNHG3 突变型（SNHG3 mutant，SNHG3-MUT）双荧光素酶报告载体，分别转染miRNC 和miR-514a-5p 至U-2OS 细胞。转染48 h，采用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同细胞中的表达水平比较

骨肉瘤细胞SW-1353、HOS、U-2OS、Saos-2 中SNHG3 表达高于成骨细胞hFOB1.19，miR-514a-5p表达低于成骨细胞hFOB1.19，差异有统计学意义（P <0.05）。见表1。

表1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同细胞中的表达水平比较（，n=9）

表1 SNHG3 和miR-514a-5p 在不同细胞中的表达水平比较（，n=9）

注：与hFOB1.19 组比较，aP <0.05。SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.2 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表达比较

si-SNHG3 组的SNHG3 表达、细胞活力、c-Myc蛋白表达低于si-NC 组，细胞凋亡率、Bax 蛋白高于si-NC 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表2。

图1 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表达比较

表2 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表达比较（，n=9）

表2 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞增殖、凋亡及c-Myc、Bax 蛋白表达比较（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.3 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞迁移和侵袭及MMP-2 蛋白表达比较

si-SNHG3 组迁移细胞、侵袭细胞和MMP-2 蛋白表达低于si-NC 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图2、表3。

表3 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞迁移和侵袭及MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

表3 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞迁移和侵袭及MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

图2 敲低SNHG3 后U-2OS 细胞迁移和侵袭及MMP-2 蛋白表达比较

2.4 双荧光素酶验证结果

SNHG3 与miR-514a-5p 存在互补的结合位点，见图3。miR-514a-5p 组SNHG3-WT 荧光素酶活性低于miR-NC 组，差异有统计学意义（P <0.05）；miR-514a-5p 组与miR-NC 组SNHG3-MUT 荧光素酶比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

图3 SNHG3 和miR-514a-5p 结合位点

表4 双荧光素酶验证结果（，n=9）

表4 双荧光素酶验证结果（，n=9）

注：SNHG3-WT：SNHG3 野生型；SNHG3-MUT：SNHG3 突变型；SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

2.5 过表达miR-514a-5p 后U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达比较

miR-514a-5p 组miR-514a-5p 表达、细胞凋亡率、Bax 蛋白表达高于miR-NC 组；细胞活力、迁移细胞、侵袭细胞、c-Myc 和MMP-2 蛋白表达低于miRNC 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图4、表5。

表5 过表达miR-514a-5p 后U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

表5 过表达miR-514a-5p 后U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

图4 过表达miR-514a-5p 对U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

2.6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 对U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2蛋白表达比较

si-SNHG3+anti-miR-514a-5p 组的miR-514a-5p 表达、细胞凋亡率、Bax 蛋白表达低于si-SNHG3+anti-miR-NC 组；细胞活力、迁移细胞、侵袭细胞、c-Myc 和MMP-2 蛋白表达高于si-SNHG3+antimiR-NC 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图5、表6。

表6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 对U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

表6 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 对U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及c-Myc、Bax 和MMP-2 蛋白表达比较（，n=9）

注：SNHG3：核仁小分子RNA 宿主基因3

图5 抑制miR-514a-5p 后敲低SNHG3 对U-2OS 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

3 讨论

随着医学治疗水平的进步，新的辅助治疗骨肉瘤方法已经取得了明显的作用效果，但是仍会出现复发、转移等不良后果[11-12]。LncRNA 是一种非编码RNA分子自身没有编码蛋白质的功能，但是可以通过转录或转录后调控基因的表达[13-14]。Ju 等[15]研究结果显示，SNHG5 在骨肉瘤细胞中表达上调，抑制SNHG5 表达，可以明显抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Xu 等[16]研究结果显示，SNHG4 在骨肉瘤组织和细胞中表达上调，其高表达与肿瘤大小和预后不良有关，SNHG4 可以海绵化miR-224-3p 调节骨肉瘤细胞的增殖和转移。Chen 等[17]研究结果显示，SNHG3 在骨肉瘤组织中表达上调，与患者预后和肿瘤大小有关，抑制SNHG3表达，可以明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，与本研究结果相似。本研究结果显示，在骨肉瘤细胞中SNHG3 表达上调，敲低SNHG3 可以抑制U-2OS 细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，提示SNHG3 可以作为骨肉瘤潜在生物标志物。

miRNA 是一种具有高度保守的非编码RNA 分子，可以通过调控靶向mRNA 表达参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程[18-19]。miRNA 在骨肉瘤细胞中起着抑癌或促癌的作用，其中miR-1284、miRNA-206、miR-493-5p、miR-501-3p 和miR-502-5p 等已证实[20-21]。miRNA-708 在骨肉瘤细胞中表达下调，miRNA-708 通过CUL4B 调节骨肉瘤细胞的增殖和凋亡[22]。Wang 等[23]研究结果显示，miR-423-5p 在骨肉瘤组织和细胞中表达下调，miR-423-5p 通过靶向STMN1 抑制骨肉瘤细胞增殖、转移。Wu 等[24]研究结果显示，miR-17 在骨肉瘤细胞中表达上调，miR-17可以上调SASH1 的表达，对于骨肉瘤细胞增长、迁移有一定抑制作用，同时还可以促进细胞凋亡，与本研究结果相反。miR-514a-5p 在肝癌、鼻咽癌等癌症中表达下调[25]，在肿瘤细胞中起着抑癌的作用。本研究结果显示，在骨肉瘤细胞中miR-514a-5p 表达下调，过表达miR-514a-5p 可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。进一步实验结果显示，SNHG3 可以靶向miR-514a-5p 的表达，而抑制miR-514a-5p 逆转了敲低SNHG3 对U-2OS 细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用，提示敲低SNHG3 可以通过调控miR-514a-5p 发挥在骨肉瘤细胞中的作用。

综上所述，SNHG3 在骨肉瘤细胞中表达上调，敲低SNHG3，或有效调控miR-514a-5p 表达，可以明显抑制骨肉瘤细胞增长、迁移、侵袭作用，同时促进细胞凋亡，为骨肉瘤临床治疗提供新的作用靶点。