基于网络药理学和分子对接探讨二仙汤治疗高血压的作用机制

孟 园 李 平 刘 欣 袁 晶

1.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京 100029；2.北京中医药大学，北京 100029

高血压是临床常见的心血管疾病，在全国乃至全球范围内发病率和死亡率占较大比例，易合并脑血管意外、认知障碍、糖尿病等，极大地增加了社会负担，同时其还是心血管疾病和其他疾病的主要死因。尽管目前高血压的防治取得了一定进展，但仍任重而道远。高血压的发生除了与遗传、饮食、情志等相关外，与性别亦有重要关系，其发病机制复杂，青年期男性发病率多高于女性，绝经前后女性发病率赶超同年龄男性[1]，且较男性血压更不易控制[2]，因此高血压的防治成为国内外研究的重点。中医学无“高血压”病名，一般将其归于“眩晕”“头痛”及“经断前后诸证”范畴。二仙汤是名老中医张伯讷教授的自创方，由淫羊藿、仙茅、黄柏、知母、巴戟天和当归组成，具有温肾益精、滋阴泻火的作用，能调节性腺轴功能和激素水平，改善内分泌及心脏功能和血压水平[3-6]。但作为中药复方，二仙汤中的有效成分复杂、涉及的靶点和通路较多，难以阐明复方发挥作用的具体机制。因此，本研究应用网络药理学及分子对接的方法，探索二仙汤治疗高血压的作用机制，为其治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 二仙汤有效成分、靶点及疾病靶点的获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索二仙汤中药物，以生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为条件筛选，并获得各成分对应的靶点。通过Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点名转化为标准基因名。以“Hypertension”为检索词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、在线人类孟德尔遗传数据库（https://omim.org/）和Therapeutic target database 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）检索高血压靶点。

1.2 有效成分和交集靶点网络及蛋白质-蛋白质相互作用网络（proteinprotein interaction，PPI）的构建

对药物靶点和疾病靶点取交集，运用Cytoscape软件构建有效成分和交集靶点网络图。交集靶点上传String 数据库（https://string-db.org），PPI 评分设为0.7。通过Cytoscape 软件实现网络可视化，筛选度值大于所有节点度值中位数两倍的节点为关键靶点[7]。

1.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析及“药物-成分-靶点-通路”网络构建

运用DAVID 6.7 数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）对关键基因进行GO 和KEGG 富集分析，通过Cytoscape软件建立“药物-成分-靶点-通路”图。

1.4 分子对接验证

筛选出“药物-成分-靶点-通路”中排名靠前的靶点和有效成分，并下载有效成分的3D 结构（mol2 格式），进行加氢、加电荷、检测配体的root、可旋转键的搜寻与定义等操作。下载靶蛋白的三维结构，并添加所有氢原子、计算Gasteiger 电荷、合并非极性氢。参数exhaustiveness 设为20，其他参数为默认值。采用Autodock vina 1.1.2 进行半柔性对接，并使用Pymol作图。

2 结果

2.1 二仙汤有效成分、靶点及疾病靶点的筛选

通过TCMSP 获得二仙汤的有效成分，其中淫羊藿23 个，仙茅7 个，巴戟天20 个，当归2 个，知母15 个，黄柏37 个，总靶点共218 个。共得到高血压靶点1073 个。

2.2 活性成分和交集靶点网络及PPI 网络的构建

共得到101 个交集靶点。二仙汤药物-有效成分-交集靶点网络中共有294 个节点，933 条边。度值最高的有效成分分别是槲皮素、山柰酚和木犀草素。PPI网络中共涉及101 个节点，739 个PPI 关系，见图1。筛选出关键靶点共20 个，其中白细胞介素（interleukin，IL）-6 的度值最高，为48。

图1 二仙汤的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.3 GO 和KEGG 富集分析及“药物-成分-靶点-通路”网络

GO 富集分析共得到315 个条目（P ＜0.01），其中生物过程300 个，根据P 值从小到大排列选取前20 个，主要涉及细胞凋亡、对细菌和脂多糖的反应、促进细胞增殖与一氧化氮（nitric oxide，NO）合成等。细胞组成7 个，包括胞外区、膜封闭腔、核质及细胞器腔等。分子功能8 个，主要影响细胞因子、生长因子及蛋白激酶的活性、一氧化氮合酶调节剂的活性及等，见图2。共得到信号通路25 条（P ＜0.01），根据P 值从小到大排列选取前20 个。见图3。构建“药物-成分-靶点-通路”图，见图4。其中矩形为药物，六边形为药物成分（圆形为共有成分），V 形为通路，菱形为靶点。其中涉及57 个有效成分，101 个靶点，25 条通路。度值较高的成分有槲皮素、山柰酚和木犀草素等，靶点有前列腺素内过氧化物酶（prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS）2、PTGS1、丝裂原活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）1、Akt 激酶（Akt kinase，AKT）1 等。

图2 GO 功能富集图

图4 药物-成分-靶点-通路图

2.4 分子对接验证

根据“药物-成分-靶点-通路”网络筛选出度值最高的5 个有效成分和4 个靶蛋白。结果显示，蛋白和有效成分对接的结合能均小于-5 kJ/mol（结合能小于-5 kJ/mol 提示配体和受体结合良好），提示靶蛋白和有效成分能稳固结合。其中PTGS2、PTGS1 分别与有效成分槲皮素、木犀草素结合最紧密，MAPK1 和AKT1 与脱水淫羊藿素结合最为密切。见图5。

图5 二仙汤的分子对接图

3 讨论

本研究结果提示，槲皮素、山柰酚及木犀草素等可能是二仙汤发挥作用的主要成分。研究表明，槲皮素有一定的降血压作用[8]，其机制可能包括抗氧化、内皮依赖性及非内皮依赖性内皮功能改善等[9]，此外还能通过Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）4 降低心肌纤维化程度[10]。木犀草素能升高高血压大鼠的NO水平，降低血管紧张肽（angiotensin，Ang）Ⅱ和内皮素-1浓度[11]，通过升高细胞内Ca2+浓度改善肾性高血压[12]，并下调PI3K-Akt 通路、调节MAPK 通路和抑制活性氧生成以抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖和迁移[13-14]。山柰酚能通过下调MAPK 通路逆转内皮损伤及其炎症反应[15]，增强内皮依赖性血管舒张功能[16]。PPI 网络提示IL-6、AKT1及MAPK1 等在高血压中发挥重要作用。有研究表明，IL-8、IL-6 和肿瘤坏死因子等炎症因子可触发正常人体中由Ang-Ⅱ引起的高血压[17]。PTGS2 编码的环氧合酶2 主要在炎症因子、Ang-Ⅱ等因素刺激下诱导性表达，抑制其在造血细胞中的表达可促进盐敏感性高血压的发生[18]。

从富集分析来看，二仙汤主要通过细胞凋亡和增殖、对细菌的反应、NO 的合成等过程及Toll 样受体通路、MAPK 通路、核苷酸结合寡聚结构域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）样受体（NOD-like receptor，NLR）通路、促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）通路等调节血压。TLR 在高血压的慢性炎症、氧化应激及血管重塑中充当重要角色[19]，其中Ang-Ⅱ诱导的高血压与TLR3-β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白通路的激活有关[20]。NLR 能与其他蛋白结合形成NLR 家族炎症小体（NOD-like receptor protein，NLRP）。NLRP3 可激活高血压中VSMC 增殖及表型转化，敲除NLRP3 基因后上述表现明显改善[21]。NO 能抑制GnRH 神经元放电以调节GnRH 的分泌和活性，而参与合成NO 的神经型一氧化氮合酶可能在雌激素负反馈抑制GnRH 水平中发挥了重要作用[22]。GnRH 作用于垂体前叶的G 蛋白偶联受体，通过G 蛋白α 亚基家族介导MAPK 级联的激活（包括p38MAPK及胞外信号调节激酶通路）[23]。研究表明，p38MAPK通路的激活能促进内皮型一氧化氮合酶磷酸化，增强NO 的信号转导，并抑制活性氧的生成[24]。而阻断胞外信号调节激酶信号传导能抑制VSMC 增殖，进而改善血管重构[25]。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术探索了二仙汤治疗高血压的可能机制，即通过槲皮素、山柰酚与木犀草素等介导Toll 样受体通路、MAPK通路、NOD 样受体通路及GnRH 通路等发挥调节内皮功能、抗炎、抑制VSMC 增殖和迁移及抗氧化等作用，体现了中药复方多成分、多靶点和多通路的特点，为其指导临床应用提供理论依据，为后续二仙汤治疗高血压提供了理论基础，但仍需进一步的研究和推广。