速生型普通产酮基古龙酸菌的高通量筛选方法

卢晓明，李晓东

（石药集团 维生药业（石家庄） 有限公司，河北 石家庄 050035）

0 引 言

国内维生素C 的生产采用两步发酵的生产工艺，第1 步是单菌发酵，将D- 山梨醇转化成L-山梨糖；第2 步是混合菌发酵，通过普通产酮基古龙酸菌（Ketogulonicigenium vulgare） （俗称小菌）及其伴生菌巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）（俗称大菌） 的共同作用将L- 山梨糖转化成2- 酮基- L- 古龙酸（2- KGA），其中小菌为产酸菌，其代谢产酸能力决定发酵强度。因此，选育生长快、产酸速率高的速生型小菌是提高生产效率的关键。

普通产酮基古龙酸菌的生长代谢受多种脱氢酶的影响，由于菌株诱变后菌体形态和菌落特征发生改变的几率很小，挑选没有目的性。为了避免漏筛，对诱变后存活单菌落基本上是全部检测，由于菌落直径不足1 mm，常规的筛选方法需将单菌落富集培养后，再通过试管或摇瓶培养，根据每个菌株的生长产酸情况判定取舍，筛选量大，且周期很长。

琼脂平板筛选法和微孔板筛选方法是目前常用的2 种筛选方法。

刘志钰等人通过抑菌圈和微孔板法筛选出高产菌。

刘堂浩等人利用荧光强度变化高通量筛选产酪氨酸酿酒酵母。

目前，尚无普通产酮基古龙酸菌基于酶学特性及产物特点等方面的高通量筛选方法的报道。由于普通产酮基古龙酸菌为好氧菌，生长较慢，对杂菌的抵御能力弱，筛选过程需振荡培养，并保证无菌度，不适于用微孔板或深孔板培养等装置进行筛选。

基于上述原因，为了防止漏筛、提高筛选效率和准确性，本研究对检测手段和培养装置进行更新，通过在固体平板和液体培养基中添加适量混合指示剂，使反应体系在pH=6.0～7.0 颜色变化灵敏；同时，采用可灭菌的2 mL 圆底离心管作为培养装置，装液量少，可直接培养小菌单菌落，无需先经过扩大培养再检测。

建立了基于培养基颜色鉴别与离心管组合培养相结合的适用于普通产酮基古龙酸菌的高通量筛选方法，缩短了检测周期，并大幅提高了单次检测数量。通过此方法，选育得到了一株生长快产酸高的速生型菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株普通产酮基古龙酸菌，编号为843，由维生药业（石家庄） 有限公司提供。

1.1.2 试 剂

（1） 溴甲酚紫。

（2） 溴百里酚蓝。

（3） 甲基红。

以上试剂均购自于天津科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 仪 器

（1） 生物显微镜：XSP- 9CP，上海光密仪器。

（2） 恒温培养摇床：QYC- 2112，上海福玛。

（3） 恒温培养箱：DPX- 9082B，上海福玛。

（4） 洁净工作台：SW- CJ- 1CU，苏净安泰。

（5） 全自动发酵罐：BLBIO- 50SQA，上海百仑。

1.1.4 培养基

（1） 鉴别固体培养基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白胨8、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、CaCO31、溴甲酚紫、溴百里酚蓝、甲基红混合指示剂0.05、琼脂15，pH=7.0～7.5。

（2） 鉴别种液培养基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米浆3、蛋白胨10、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、溴甲酚紫、溴百里酚蓝、甲基红混合指示剂0.02，pH=6.8～7.2。

（3） 发酵培养基(g/L)：山梨糖80、酵母膏1、玉米浆12、尿素10、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.1、CaCO35，pH=6.8～7.2。

1.2 方 法

1.2.1 诱变菌株的固体平板鉴别

（1） 稀释分离：将经过诱变处理的小菌菌体悬液用无菌蒸馏水逐级稀释至1/1000，吸取0.05～0.1 mL 稀释液，均匀涂布于鉴别固体养基平板中，在30±2 ℃静置培养。

（2） 鉴别培养：恒温培养48 h，开始观察单菌落生长和菌落周围培养基颜色改变情况。

1.2.2 诱变菌株的菌液鉴别

（1） 培养装置的设计制作

将数十支2 mL 圆底离心管置于1 个离心管盒中，组成1 个培养单元，每支离心管分装0.5 mL鉴别种液培养基，在121±1 ℃灭菌15 min，备用。每批次根据待检菌株的多少设置培养单元的数量。

（2） 种液鉴别培养

在洁净工作台上，用无菌勺挖取平板上诱变存活的单菌落，接入装有无菌鉴别种液培养基的离心管中，立即关闭管盖，每个菌落对应1 支离心管。从每个培养单元中取1 支管，同时接入1 个未经诱变的对照单菌落，作为阳性对照，1 支空白培养基作为对照。

在30±2 ℃、200 r/min 条件下振荡培养24 ～48 h，观察菌液的颜色变化。

1.2.3 培养基颜色变化程度与产酸关系的判断

（1） 固体平板：挑取变色程度及变色圈大小不同的小菌单菌落，分别接入装有鉴别种液培养基的离心管中，并留一管培养基作为空白对照。

在30±2 ℃、200 r/min 条件下振荡培养40 ～48 h，观察颜色变化。

（2） 种液培养基：挑取1 个大菌单菌落，溶于10 mL 无菌水中，振荡形成菌悬液。分别吸取0.1 mL 大菌菌液，接入（1） 所述的离心管组中的变色程度不同的小菌菌液中，组成大小菌混合液。摇匀后，全部转移至30 mL/250 mL 三角瓶种液培养基中。在30±2 ℃、200 r/min 条件下培养18 ～24 h，测定2- KGA 的生成量。

再吸取5 mL 种液，转接入40 mL/500 mL 三角瓶的发酵培养基中，发酵培养24、48 h，取样测定2- KGA 的生成量，考察离心管菌液的变色程度及变色时间与产酸的关系。

1.2.4 速生菌株的验证

将通过上述方法得到的速生型菌株与对照菌株进行对比实验。制备出2 个菌株的大菌与小菌的混合斜面，用接种环分别刮取一环菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶种液的培养基中。在30±2 ℃、200 r/min 条件下培养17～20 h，即完成了种液的制备。

再吸取5 mL 种液，转接入40 mL/500 mL 三角瓶发酵培养基中进行发酵对比，测定不同时期的产酸量。

2 结果与分析

2.1 固体平板鉴别结果

经过诱变的小菌悬液，在鉴别固体培养基中培养48 h，开始观察单菌落生长状态和菌落周围培养基颜色改变情况。此后每隔8 h 观察一次，单菌落周围的培养基颜色开始变黄时进行标记，编号原则为首次发生变色时间- 菌落序号。

单菌落产酸初筛鉴别代表性结果如图1 所示。

图1 单菌落变色圈Fig. 1 Discolored circle of single colony

2.2 种液筛选结果

挑取固体平板上的诱变存活的单菌落，分别接入离心管组的鉴别种液的培养中，振荡培养24～ 48 h。

观察部分离心管中的菌液颜色陆续发生改变，从蓝绿色变为淡绿色，继续培养，颜色逐渐变为黄色，目测能分辨各管间存在的颜色差异。至培养结束，空白培养基变为蓝绿色，阳性对照管为淡黄绿色，颜色越黄，pH 值相对越低。

菌液颜色变化情况结果如图2 所示。

图2 菌液颜色变化情况Fig. 2 Color change of bacterial liquid

2.3 菌液颜色变化与产酸的对应关系

对经过离心管组鉴别培养得到的混合液，先进行种液培养，再转接入发酵培养基中进行发酵培养和产酸检测，考察鉴别培养基中菌液颜色变化与2- 酮基- L- 古龙酸生成量是否存在对应关系。

菌株编号原则为单菌落首次发生变色的时间-菌落序号。菌液颜色变化与产酸对应关系的检测结果见表1。

表1 菌液颜色变化与产酸对应关系Table 1 Corresponding relationship between color change of bacterial liquid and acid production

菌液出现颜色变化的程度与其产酸能力的对应 趋势如图3 所示。

图3 颜色变化的程度与产酸能力的对应趋势Fig. 3 Corresponding trend between the degree of color change and acid prodution capacity

由表1、图3 可以看出，在鉴别固体培养中，最早出现变色圈的菌株K56- 1、K56- 2 在种液鉴别培养过程中也率先产生颜色变化，且种液最早出现变色的K56- 1 黄色最深，种液和发酵瓶培养产酸量也相对最高。结果反映出种液变黄的时间和程度与菌株的产酸量呈现一定的对应关系。

2.4 速生菌株的发酵数据验证

2.4.1 摇瓶发酵对比确定速生型菌株

将初筛得到的鉴别培养变色较早、产酸相对较高的K56- 1、K56- 2、K64- 1、K64- 2 4 个菌株与对照菌株进行摇瓶发酵对比实验，确定速生型菌株。

首先制备上述菌株的大菌和小菌混合斜面，用接种环分别刮取一环菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶种液培养基中，在30±2 ℃、200 r/min 条件下培养19 h，完成种液制备。

再吸取5 mL 种液，转接入40 mL/500 mL 三角瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵对比，测定不同时期的产酸量。

摇瓶发酵对比数据结果见表2。

表2 摇瓶发酵对比数据Table 2 Comparison data of shake flask fermentation

由表2 可以看出，经过3 批次的对比实验，菌株K56- 1 生长产酸具有明显优势，选定将该菌株作为速生型新菌种进行发酵验证。

2.4.2 发酵数据验证

利用2 个50 L 发酵罐，将速生型菌种K56- 1与生产对照菌种进行平行实验，发酵验证数据结果见表3。

表3 发酵验证数据Table 3 Fermentation verification data

由表3 可以看出，K56- 1 平均发酵的周期缩短2.38 h， 产酸速率提高0.18 mg/ (mL·h)， 约占7.23%，验证了新菌种K56- 1 具有速生、产酸快的性能优势。

3 结果讨论

近年来，基于荧光信号的高通量筛选，以及迅速发展的超高通量FACS 和DMFS ，已成为酶和细胞工厂改造中最新应用。

Liu Yongfei 等人通过建立色氨酸特异性适配体生物传感器和荧光激活液滴分选技术，筛选到色氨酸高产菌株。

本研究根据普通产酮基古龙酸菌在生长代谢过程中可将底物山梨糖氧化生成2- 酮基- L- 古龙酸，使反应体系pH 值下降的特点，开发了指示剂鉴别检测方法，并利用离心管所具备的密闭性好、高温灭菌、避免孔板培养无法确保无菌度的弱点、可振荡培养满足菌株的好氧需求等优势，实现了普通产酮基古龙酸菌速生菌株的高通量筛选。

4 结 语

实验结果证实本研究建立的指示剂鉴别检测的方法可行，菌株生长产酸情况与培养基颜色变化存在一定的对应关系，可用于普通产酮基古龙酸菌的筛选。

离心管组合培养技术既可满足单管独立进行无菌操作和振荡培养需求，又可组合进行批量培养和检测，达到了快速便捷的高通量筛选目的。

通过此方法选育得到了生长快、产酸高的速生型普通产酮基古龙酸菌株K56- 1，经过发酵验证，与对照菌种相比，其发酵平均周期缩短2.38 h，2- KGA 生成速率提升7.23%。