酶法制备富含中碳链甘油二酯的山苍子核仁油工艺研究

李桥妹 王宗德 谢礼文黎冬明, 范国荣 陈尚钘

(江西农业大学食品科学与工程学院1，南昌 330045)(江西农业大学林学院；国家林草局木本香料(华东)工程技术研究中心；国家林草局/江西省樟树工程技术研究中心2，南昌 330045)

山苍子为樟科木姜子属落叶灌木或小乔木，主要分布在我国长江以南的向阳丘陵、山地灌木丛或疏林中[1, 2]。山苍子核是山苍子经水蒸气蒸馏出表皮精油后剩余得到的固体残渣。山苍子精油中含有丰富的柠檬醛，其质量分数占60%～80%，是合成紫罗兰酮、甲基紫罗兰酮等名贵香料的理想原料[3, 4]。山苍子核仁含油量可达40%以上，其中C10和C12这两种中碳脂肪酸甘油酯占90%以上[1, 5]。中碳脂肪酸甘油酯在食品、化妆品、药品等方面的应用越来越广泛，由于代谢的特殊性，可减少血清胆固醇和肝胆固醇量，对于动脉硬化、血栓症有一定的疗效[6]。江西省含有丰富的山苍子资源，但是一些加工企业或个人将山苍子核直接废弃或者焚烧，不仅造成了资源的浪费，而且还会对环境造成污染。若将山苍子核仁油中的中碳脂肪酸甘油酯加以充分利用, 使其产生良好的经济效益、社会效益和生态效益，具有重大的意义。

甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)是甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)中一个脂肪酸被羟基所取代的结构脂质，DAG有1,2-DAG和1,3-DAG这两种同分异构体[7]。DAG在天然油脂中的含量虽然很低，但它却是合成甘油三酯、磷脂和糖脂的前体物质，是油脂在体内代谢的中间产物，是重要的生物物质[8]。早期发现，在食品、化妆品和制药等行业领域中，DAG是重要的表面活性剂。近年来，有研究表明它具有减肥，降血脂等功能[9]。中链脂肪酸具有减少体内脂肪积累、快速供应能量、提高葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗等功能[10]。中碳链DAG不但具有DAG和中链脂肪酸的生物学功能，而且它的保健功能显著，可用于减肥功能性食品中，具有较好的经济价值和应用前景[11]。

目前，根据制备机理的不同，国内外DAG的制备方法主要有以下几种：甘油与脂肪酸的酯化反应、脂肪酸酯的甘油解法、油脂的水解法、脂肪酸酯的醇解法。酶法具有条件温和、高效、安全等特点，因此本文以山苍子核仁油为原料，对3种固定化脂肪酶LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435进行筛选，选择最佳的固定化脂肪酶催化油脂水解制备中碳链DAG，采用高效液相色谱仪测定中碳链DAG的含量，并通过正交试验优化油脂水解条件，为中碳链DAG在工业中生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山苍子核仁油(癸酸质量分数为19.31%，月桂酸质量分数为51.53%，月桂烯酸质量分数为14.61%)实验室提取；甲醇、乙腈、异丙醇均为色谱纯； LipozymeRMIM、LipozymeTLIM、Novozym435脂肪酶、癸酸甘油二酯、月桂酸甘油二酯。

1.2 仪器设备

FA224-型分析天平，SHZ-C-型水浴恒温振荡器，LG16-WS-型台式高速离心机,SHZ-D(Ⅲ)-型循环水式真空泵,Watere2695高效液相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 山苍子核仁油的脱胶处理

根据程谦伟[12]等的超声波辅助水化脱胶方法，稍作修改。取适量经石油醚提取的山苍子核仁油于锥形瓶中，加入4%(按核仁油质量计算)的蒸馏水，放在超声温度为50 ℃，超声功率为75 W的条件下，超声时间为8 min。取出后静置30 min，放入离心机中，设置转速为4 000 r/min，离心时间为20 min。得到上清液则为水化油脂，水化脱胶的得率为91.6%。

1.3.2 甘油二酯的制备

根据卢梦青[13]的水解法制备1,3-甘油二酯方法，稍作修改。称取适量的山苍子核仁油于50 mL具塞锥形瓶中，加入一定比例的蒸馏水混合均匀，再加入一定量的固定化脂肪酶，并将其放置在温度为70 ℃、转速为200 r/min的恒温水浴振荡器中，反应一定的时间。反应结束后，在9 500 r/min的台式高速离心机下离心8 min，将油脂与其余物质分离开，取上层油脂进行分析。

1.3.3 固定化脂肪酶的筛选

称取适量的山苍子核仁油，加入10%的蒸馏水(占油重)混合均匀，分别加入14%(占油重)固定化脂肪酶(LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435)，并置于酶适宜温度分别为50、55、70 ℃，转速为200 r/min的恒温水浴振荡器中，在反应3、4、5、6、7 h后，定时取反应产物，在9 500 r/min的台式高速离心机下离心8 min，然后取上层油脂进行检测。

1.3.4 单因素试验

以山苍子核仁油为原料，中碳链DAG含量为指标，分别对加酶量、加水量、反应时间3个单因素进行酶法制备富含中碳链DAG的山苍子核仁油工艺探究，单因素试验因素水平表见表1。

表1 单因素试验因素水平表

1.3.5 正交试验优化设计

在单因素试验结果的基础上，以加水量、加酶量、反应时间这3个因素为自变量，中碳链DAG为指标，采用DPS软件设计L9(34)的正交试验因素水平，见表2所示。

表2 正交试验因素水平表

1.3.6 中碳链甘油二酯的测定

样品前处理：取适量上述所得的上清液，用异丙醇流动相溶解样品，配制样品质量质量浓度为10 mg/mL。漩涡振荡均匀后，用0.22 μm的有机膜过滤，置于2 mL的进样瓶中，等待检测分析。

中碳链DAG的测定：采用HPLC检测中碳链DAG含量，条件如下：色谱柱为SymmetryC18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，PDA检测器；检测波长：210 nm；柱温：40 ℃；流动相∶乙腈∶异丙醇=75∶25；采用等浓度梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。通过癸酸DAG标准品与月桂酸DAG标准品的出峰时间，以此确定中碳链DAG的出峰区间，采用峰面积归一法计算中碳链DAG含量，即中碳链DAG的含量表示为中碳链DAG的峰面积之和占所有的甘油酯峰面积的百分比[14]。

2 结果与讨论

2.1 山苍子核仁油中碳链甘油二酯出峰位置的确定

山苍核仁油中的中链脂肪酸主要成分(质量分数大于10%)为癸酸、月桂酸、月桂烯酸。本文主要研究这3种脂肪酸所组成的DAG。用反相色谱柱分析时，甘油酯的出峰时间顺序与当量碳数(ECN)有关，ECN值越小就越容易出峰。一般来说，ECN值相同的甘油酯会同时出峰，仅用HPLC是比较难分开[14]。山苍子核仁油中碳链DAG的当量碳数值如表3。根据表3可知，山苍子核仁油中碳链DAG中的癸酸DAG最先出峰，月桂酸DAG最后出峰，通过测定癸酸DAG和月桂酸DAG标准样品的出峰时间，从而确定山苍子核仁油中碳链DAG的出峰时间区间为4.025～5.769 min。

表3 中碳链DAG的当量碳数值

2.2 固定化脂肪酶的筛选

选择了3种固定化脂肪酶即LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435，在其他反应条件一致的情况下，催化部分水解山苍子核仁油生成中碳链DAG，筛选出水解效率最佳的脂肪酶。以时间为横坐标、中碳链DAG含量为纵坐标作图，结果如图1所示。

图1 3种固定化脂肪酶对中碳链DAG的影响

由图1可知，对于LipozymeRMIM脂肪酶而言，反应至7 h，该脂肪酶催化部分水解反应得到中碳链DAG质量分数为41.23%；对于Novozym435脂肪酶而言，反应至7 h，该脂肪酶催化部分水解反应得到中碳链DAG质量分数为32.68%；对于LipozymeTLIM脂肪酶而言，反应至6 h时，该脂肪酶催化部分水解反应得到中碳链DAG质量分数为37.12%，此时该酶催化效率最好。可见LipozymeRMIM和Novozym435脂肪酶都随着反应时间的增加，中碳链DAG的含量也不断增加，当反应到一定的时间后，中碳链DAG含量增加的幅度很小；而LipozymeTLIM脂肪酶则是随着反应时间的延长，中碳链DAG含量先增加后减少。可以明显的看出，任意反应时间内，催化部分水解反应得到的中碳链DAG含量比其余两种脂肪酶催化部分水解反应得到的中碳链DAG含量都要高。可能是不同脂肪酶的结构存在差异，而导致催化效率不一样。因此选择LipozymeRMIM为最佳脂肪酶，继续为后续部分水解工艺进行研究。

2.3 加酶量对中碳链甘油二酯的影响

在加水量为10%(占油重)，反应时间为3 h的条件下，考察加酶量(占油重)为10%、12%、14%、16%、20%对部分水解山苍子核仁油制备中碳链DAG含量的影响，结果如图2所示。加酶量在10%到14%这个范围内，中碳链DAG含量不断的增加；当加酶量为14%时，水解得到的中碳链DAG质量分数为36.09%,此时为最大值；加酶量继续增加时，中碳链DAG含量反而减少。这是因为随着加酶量的增加，油脂与脂肪酶接触的几率增多，脂肪酶与固定含量的油脂结合的更充分，使水解反应速率加快；当加酶量增加到一定的程度时，由于固定化本身酶颗粒较大，含量过多，在反应过程中可能会阻碍酶的结合位点，导致酶的活性降低，从而使水解反应速率降低，同时反应体系的黏度也不断的增加，不利于物质传质过程[15，16]。因此，加酶量宜选择为14%。

图2 加酶量、加水量、反应时间对中碳链DAG的影响

2.4 加水量对中碳链甘油二酯的影响

在加酶量为14%(占油重)，反应时间为3 h的条件下，考察加水量(占油重)为0%、5%、10%、15%、20%、25%对部分水解山苍子核仁油制备中碳链DAG含量的影响，结果如图2所示。

由图2可知，加水量在0%到15%这个范围内，中碳链DAG含量不断的增加；当加水量增加至15%时，酶法制备得到中碳链DAG质量分数为36.36%，此时得到中碳链DAG含量为最大值；继续增加水含量，中碳链DAG含量不断的减少。这可能是因为与脂肪酶的结构特点有关。脂肪酶由亲水、疏水氨基酸这两个部分组成，而脂肪酶的活性中心是被一个亲水性的短α-螺旋覆盖，而里面则是靠近分子疏水端[17]。脂肪酶需要适量水来保激活酶的活性，使这个脂肪酶在这个油-水界面催化反应；但是含水量过多，会使水解反应发生逆反应，合成甘油三酯；虽然体系的界面面积增加,但是酶的相对浓度下降导致酶的活性有所降低，从而导致中碳链DAG含量不断的减少[18]。因此，选择加水量(占油重)为10%较为适宜。

2.5 反应时间对中碳链甘油二酯的影响

在加酶量为14%(占油重)，加水量为10%(占油重)的条件下，考察反应时间为1、3、5、7、9 h对部分水解山苍子核仁油制备中碳链DAG含量的影响，结果如图2所示。随着反应时间的延长，中碳链DAG含量逐渐增加；当反应时间到达7 h时，酶法制备得到中碳链DAG质量分数为41.44%，反应基本达到了稳定；反应时间继续增加，中碳链DAG含量增加的幅度很小。综合考虑能耗与时间等因素，反应时间选择7 h最为合适。

2.6 正交试验

以山苍子核仁油为原料，在固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化水解得到中碳链DAG的单因素分析结果的基础上，进行正交试验优化油脂水解条件。L9(34)正交试验结果如表4，方差分析表如表5，Duncan多重比较如表6。

表4 L9(34)正交试验结果

表5 方差分析表

表6 Duncan多重比较

由表4可以得出：根据R值可知在选定的加酶量、加水量、反应时间这3个因素对制备中碳链甘油二酯都存在显著影响，以加水量的影响最大，其次是加酶量、反应时间，即A>B>C；通过k值比较，得到脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解山苍子核仁油制备中碳链DAG的最优试验条件为A1B3C2。由表5中可以知道，因素A、因素B和因素C都具有差异极显著。从表6可以看出，因素A各个水平间差异极显著但水平A1的中碳链DAG含量最高，所以因素A的最佳水平选择A1；因素B各个水平间差异极显著但水平B3的中碳链DAG含量最高，因此因素B的最佳水平选择B3；因素C水平间存在差异显著，C1与C2、C3差异显著，C2与C3差异不显著且C2的中碳链DAG含量最高，因此因素C的最佳水平选择C2。可以得出脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制备富含中碳链DAG的山苍子核仁油的最佳反应条件为A1B3C2，即加水量为5%(占油重)、加酶量为16%(占油重)、反应时间为7 h。

2.7 验证试验

由正交试验确定得到脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制备富含中碳链DAG的山苍子核仁油的最佳工艺条件，即加水量为5%(占油重)、加酶量为16%(占油重)、反应时间为7 h的条件下做验证试验，做3组平行试验，取其平均值，结果如表7。

表7 验证试验结果

由表7可知，验证试验条件下得到的结果与正交表中结果比较，验证试验条件下得到的中碳链DAG含量要高于正交表里的任何一组。因此，可以确定脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制备富含中碳链DAG山苍子核仁油的最佳工艺条件为：加水量5%(占油重)、加酶量16%(占油重)、反应时间7 h。在该反应条件下制备的中碳链DAG，采用峰面积归一法计算得到中碳链DAG的质量分数为47.51%，山苍子核仁原油中的中碳链DAG的质量分数为17.24%，可见与山苍子核仁油原油中的中碳链DAG的含量相比提高了2.76倍。

3 结论

以山苍子核仁油为原料，采用脂肪酶部分水解法制备富含中碳链DAG的山苍子核仁油，利用高效液相色谱法确定反应后产物中的中碳链DAG的含量。对LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435三种固定化脂肪酶进行筛选，得出LipozymeRMIM固定化脂肪酶的催化效果最好。以LipozymeRMIM固定化脂肪酶为催化剂，催化部分水解制备中碳链DAG。在单因素结果分析的基础上，以中碳链DAG含量为指标，采用正交试验优化富含中碳链DAG的山苍子核仁油的制备条件。结果表明酶解制备富含中碳链DAG的山苍子核仁油的最佳工艺为：加水量5%(占油重)，加酶量16%(占油重)，反应时间7 h。该条件下制备中碳链DAG的质量分数为47.51%，而山苍子核仁原油中的中碳链DAG的质量分数为17.24%，可见与其原油中的中碳链DAG的含量相比提高了2.76倍。