基于固相凝集法的IgG抗-A/B检测方法的建立和评价

张 强 施晶晶 张 敏 （东南大学附属中大医院输血科，南京210009）

ABO 新生儿溶血病（ABO hemolytic disease of the newborn，ABO-HDN）是最常见的由于母胎血型不合引发的胎儿或新生儿同种免疫性溶血性疾病，一般见于含有IgG 抗-A/B 的O 型血孕妇所产的非O型血新生儿［1-2］。IgG 类抗体可穿过胎盘屏障，与含有A 或B 抗原的胎儿红细胞特异性结合，通过补体介导的细胞溶解作用导致红细胞溶解破坏，引发胎儿或新生儿贫血、高胆红素血症等，严重者需要换血［3］。研究证实，孕妇体内 IgG 抗-A/B 效价是 ABO-HDN 发生的重要因素，临床上用于检测孕妇IgG 抗-A/B 抗体效价的方法主要为试管法和微柱凝胶法［4-5］。由于血清中同时存在 IgM 和 IgG 2 类血型抗体，2 种方法均需先采用巯基乙醇（2-Mercaptoetha⁃nol，2-ME）灭活 IgM 类抗体，再检测 IgG 抗体，检测时间长，操作复杂，且2-ME 毒性较大，严重损伤环境和人体。因此，本研究拟建立一种以固相凝集法为基础的IgG 抗-A/B 效价检测方法，满足检验要求的同时显著提高检测效率，避免试剂对环境和工作人员的伤害。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 选取2019 年1 月至7 月我院门诊和住院待产的 O 型血孕妇 40 例，年龄 23～45 岁，2019 年江苏省血液中心健康献血人员63 例（A、B、AB型各20例，O型3例），微柱凝胶法检测IgG-抗A/B效价为1∶64、1∶512、1∶1 024的标本各1例。

1.2 仪器与试剂 微柱凝胶检测系统（37℃恒温孵育器、微柱凝胶卡及其配套试剂，伯乐）；96 孔U形板（上海晶安）；医用离心机（北京白洋有限公司）；低离子溶液（伯乐）；巯基乙醇（长春博讯）；抗人球蛋白（抗IgG）检测试剂盒（上海血液生物有限公司）；Rh-D（IgG）血液定型试剂（单克隆抗体，北京金豪）；磷酸盐缓冲液（pH=7.2）、1%O型指示红细胞悬液为课题组自制。

1.2 方法

1.2.1 血型抗原和指示红细胞制备 血型抗原制备：分别取A、B 血型健康志愿者唾液10 ml，1 000 g离心10 min，取上清，沸水浴煮沸10 min，灭活唾液酶，1 000 g离心10 min，收集上清。凝集抑制试验证实上清中存在A/B 血型物质，确定效价，分装，-20℃保存备用；指示红细胞制备：取3 人份O 型血献血人员细胞，盐水洗涤3 次，稀释为1%O 型红细胞悬液，取 2 ml 红细胞悬液，加入 15 μl IgG 抗-D，37℃孵育30 min，制备1%O型指示红细胞。

1.2.2 固相凝集法建立 采用磷酸盐缓冲液将A、B 血型抗原稀释至最佳浓度，包被96 孔U 形板（200 μ/l 孔），4℃ 过夜；洗涤 3 次，反应孔中加入200 μl 倍比稀释的患者血清（1∶100、1∶200……1∶1 600）和阴性对照血清，密封，37℃ 孵育30 min；洗涤5次，依次加入100 μl抗人IgG抗体及100 μl指示红细胞，混匀，200 g离心5 min，观察结果，指示红细胞平铺于反应孔底部形成细胞层为阳性，指示红细胞聚集于反应孔底部中央为阴性，以达到1+的最高稀释度作为待测血清的抗体效价。

1.2.3 特异性检验 采用包被A 抗原的96 孔U 形板检测A 及AB 型健康献血人员（无IgG 抗-A）血清各 20 例，包被 B 抗原的 96 孔 U 形板检测 B 及 AB 型健康献血人员（无IgG 抗-B）血清各20 例，同时加入IgG 抗-A 和 IgG 抗-B 阳 性 的 O 型血孕妇血清 作 为 阳性对照。

1.2.4 批内与批间差异检测 选择微柱凝胶法检测的低、中、高（IgG 抗-A 1∶64、1∶256、1∶1 024和IgG抗-B 1∶64、1∶256和1∶1 024）3个不同抗体效价水平的标本采用建议的方法进行检测，各标本连续检测20次，计算批内变异系数；对3个不同水平的标本连续检测20 d，1次/d，计算批间变异系数（CV）。

1.2.5 固相凝集检测法临床应用 分别采用固相凝集法和试管法检测40 例O 型血孕妇IgG 抗-A/B效价（20 例 IgG 抗-A、20 例 IgG 抗-B），比较 2 种检验结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计学分析，重复性验证试验中，抗体效价倒数经log转换，计算其均值（）和标准差（s）。2种方法比较试验中，抗体效价测定值以几何均数G（+1 SD，-1 SD）表示，不同方法检测结果差异比较采用配对t检验，相关性检验采用Pearson 相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血型抗原最佳包被浓度确定 制备好的血型抗原按1∶100、1∶200……1∶1 600 倍比稀释，以本研究建立的方法分别检测低、中、高效价标本，选择可同时检测出3个水平抗体的抗原最适稀释度作为包被浓度，确定包被浓度为1∶400。

2.2 特异性 采用包被A 抗原的96 孔U 形板检测无IgG抗-A的健康献血人员血清，结果均为阴性；采用包被B抗原的96孔U 形板检测无IgG 抗-B的健康献血人员血清，结果均为阴性，阳性对照血清均为阳性。说明包被最佳浓度血型抗原的96 孔U 形板可特异性检测到相应抗体的血清，与非特异性抗体不发生反应，本研究建立的固相凝集方法特异性良好。

2.3 重复性验证 3 个不同抗体效价水平的血样经连续检测，效价倒数经log转换，计算其、s及CV，得到 IgG 抗-A 的批内差异为 2.19%～6.90%（<10%），批间差异为4.47%～8.15%（<10%）；IgG 抗-B的批内差异为3.03%～6.10%（<10%），批间差异为3.17%～8.80%（<10%）。见表1。

表1 固相凝集法检测IgG抗-A/ B的批内及批间差异Tab.1 Intra-and inter-assay coefficients of variations for IgG-A/ B antibody titer detected by Solid Phase Agglutination

2.4 不同检测方法比较 分别采用固相凝集法和试管法检测40 例O 型血孕妇抗体效价（20 例IgG抗-A、20 例 IgG 抗-B），配对t检验结果显示，固相凝集法检测IgG 抗-A/B 的灵敏度高于试管法，IgG 抗-A/B 测定值分别为试管法的5.86 倍和9.19 倍，差异有统计学意义（P<0.05，表2）。Pearson 相关分析显示，2 种方法的检测结果高度相关，IgG 抗-A 检测相关系数为0.700，IgG抗-B检测相关系数为0.638，差异有统计学意义（P<0.05，表3）。

表2 固相凝集法与试管法检测结果比较Tab.2 Comparison of Solid Phase Agglutination and Tube Test

表3 固相凝集法与试管法相关性分析Tab.3 Pearson correlation analysis of Solid Phase Agglu⁃tination and Tube Test

3 讨论

本研究采用唾液血型物质作为包被抗原，成功建立了IgG 抗-A/B 检测的固相凝集检测方法，并进行了系统评价和初步应用，本方法特异性高，重复性好，检测结果与经典方法高度相关。

目前临床常用孕妇抗体效价检测方法主要为试管法和微柱凝胶法。试管法是检测血型抗体效价的经典方法，操作复杂，未被完全灭活的IgM 抗体和IgA 抗体干扰可引发盐水凝集导致假阳性，现已不常用。微柱凝胶法利用分子筛作用，将凝集红细胞与游离红细胞分开，灵敏度较高，但存在明显不足，未灭活完全的IgM 抗体、高白细胞、冷凝集及异常蛋白等均会引发假阳性［6-8］。近年固相凝集法检测血小板抗体及血小板交叉配型的试剂盒已成功应用于临床，且具有较高特异性和敏感性［9-10］。本研究采用特异性单抗（抗人IgG）作为二抗及IgG 抗-D致敏的O 型红细胞作为指示红细胞，检验过程不受IgM 类血型抗体干扰，无需灭活IgM 类抗体，显著缩短检测时间（相比于试管法和微柱凝胶法可节省30～60 min），明显提高检测效率［11］。同时该法避免使用2-ME 等有毒试剂，使工作人员免受毒性试剂损伤，且灵敏度高于试管法，其IgG 抗-A/B 的测定值分别为试管法的5.86 倍和9.19 倍。Pearson 相关性分析结果显示，2 种方法检测IgG 抗-A/B 的结果显著相关。另外，本研究以分泌型人唾液中的血型物质作为包被抗原，其仅与含有相应IgG 抗体的血清反应，不与阴性对照血清发生交叉反应，保证该方法特异性良好。重复性试验显示，该方法检测IgG 抗-A/B 的批内和批间变异系数均<10%，具有较好的重复性和精密度。

综上所述，本研究建立方法特异性和灵敏度较高，重复性好，无毒性试剂污染，且操作简便省时，为检测孕妇血清IgG抗-A/B抗体效价提供了可靠手段。