猪肺炎支原体灭活疫苗的实验室效力研究

李秋菊，王丹辉，沈青春，高玉龙

（1.松原职业技术学院，吉林 松原 138000；2.前郭县动物疫病预防控制中心，吉林 松原 138000；3.中国兽医药品监察所，北京 100081；4.吉林和元生物工程股份有限公司，吉林 松原 138000）

猪支原体肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由猪肺炎支原体 （Mycoplasma hyopne umoniae，Mhp）引起的一种慢性、接触性呼吸道传染病，临床上有独特的咳嗽和喘气症状，又称猪喘气病或猪气喘病[1]，该病分布十分广泛，世界各地均有发生，也被认为是危害各国养猪业的重要疫病之一[2]。该病发病率高，发病慢且长，以冬春寒冷季节多发。发病猪表现为流涕，咳嗽，气喘。死亡率虽不高但猪肺炎支原体也能够导致由特定病毒性病原包括猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环2型病毒感染所引发的疾病[3]。

近年来，美国每年该病的疫苗产量一直占据榜首，主要为灭活疫苗，而我国多年来主要以研究活疫苗为主，近年也开始了灭活疫苗的研制工作。猪支原体肺炎灭活疫苗是最新研发用于预防猪支原体肺炎的灭活疫苗。该疫苗采用了田间分离的野毒菌株，免疫原性好。通过使用不同剂量的疫苗免疫健康仔猪，评价其攻毒保护力，确定其最小免疫剂量。本试验结果对该疫苗的临床使用有着重要的参考意义，同时也为进一步探明免疫保护率与替代动物抗体水平的相关研究提供技术数据。

1 试验材料

1.1 试验疫苗

猪支原体肺炎灭活疫苗 （S株）， 批号为202103，灭活菌滴度为 2.18×108CCU50/mL，规格为 20 mL/瓶。

1.2 攻毒菌种

猪肺炎支原体济南株组织毒，批号为202101，1 mL/支。

1.3 试验猪

7～14日龄健康仔猪，共45头，仔猪均一性好，淘汰同窝中弱小仔猪，未免疫猪肺炎支原体疫苗；猪肺炎支原体抗体呈阴性，猪瘟、蓝耳病和伪狂犬抗体均呈阴性。

1.4 试剂

猪肺炎支原体抗体ELISA检测试剂盒，购自美国IDEXX公司，2～8℃保存。猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸道综合征病毒通用型RT-PCR检测试剂盒、猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒，均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，-15℃保存。

1.5 其他

无抗饲料购自北京科奥协力饲料有限公司。

2 试验方法

2.1 试验猪的筛选

筛选猪肺炎支原体抗体检测应为阴性，猪瘟、猪蓝耳病和伪狂犬抗原应为阴性，7～14日健康仔猪共25头，前期与母猪一同饲养。

2.2 免疫前的准备及分组免疫

对每头仔猪打耳标、称重，分别使用2 mL(1～5号猪)、1 mL（6～10 号猪）、0.5 mL（11～15 号猪）和 0.25 mL（16～20号猪）剂量，每组5头仔猪，两次免疫分别在两侧颈部肌肉注射，同时设5头不免疫对照组（21～25号猪），另外2 mL剂量组多免疫两头，为后续组织切片所用。

2.3 攻毒试验

首免后28日，连同对照组5头仔猪各气管内接种1:100倍稀释的猪肺炎支原体济南株组织毒10 mL（约含肺组织0.01 g）。连续观察28日后剖检，观察记录肺脏病变情况。

2.4 观测项目

2.4.1 体温测定。分别于免疫前和免疫后对所有仔猪进行体温测量，每天1次，持续7 d。

2.4.2 每日观察注射部位情况，注射2 mL的试验仔猪分别于二免后第7 d和第14 d各宰杀一头，取注射部位的肌肉组织经10%福尔马林固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色等，显微镜下观察，并进行组织病理学评价。

2.4.3 称重。于免疫、攻毒当日和试验结束日对所有仔猪进行称重。

2.4.4 肺脏病变评价及计算。按照规程附注5的评分标准对猪肺脏进行逐个评价，左、右心叶出现100%病变各记1分，左、右尖叶出现100%病变各记1分，左、右膈叶出现100%病变各记0.5分，中间叶出现l00%病变记0.5分，病变总分为5.5分。根据肺脏出现病变的轻重程度加减分值。同一个肺叶的正反两面病变面积不一致时，取平均面积。如图1中感染猪支原体肺炎的猪肺脏评分，左心叶病变70%，计0.7分；右心叶病变50%，计0.5分：左尖叶病变80%，计0.8分；右尖叶病变60%，计0.6分；左膈叶病变20%，计0.1分，右膈叶病变20%，计0.1分；中间叶病变40%，计0.2分，则病变总分=左心叶+右心叶+左尖叶+右尖叶+左膈叶+右膈叶+中间叶=0.7+0.5+0.8+0.6+0.1+0.1+0.2=3.0。

图1 猪支原体肺炎的肺脏病变图

保护率计算公式如下：

3 试验结果

3.1 体温变化情况记录结果

免疫前1天和当天（免疫前），体温测定结果如图2所示。

图2 不同剂量猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）首免后仔猪体温测定结果

以上结果显示，健康仔猪免疫后体温正常，疫苗免疫剂量与体温变化关系不明显。

二免前1天和当天，对各个滴度免疫组的试验猪进行体温测定，测定结果如图3所示。

图3 不同剂量猪支原体肺炎灭活疫苗(S株)二免后体温测定结果

以上结果显示，健康仔猪在免疫后体温正常，疫苗免疫剂量与体温变化关系不明显。

3.2 注射部位的不良反应记录结果

使用4种不同剂量的猪支原体肺炎灭活疫苗的注射部位是否有不良反应或变化，结果见表1。对注射2 mL剂量组仔猪注射部位的肌肉组织进行切片观察，结果见图4。

图4 支原体肺炎灭活疫苗2 mL剂量免疫组仔猪注射部位病理组织切片结果

表1 不同剂量猪支原体肺炎灭活疫苗免疫仔猪后7日内注射部位反应情况观察表

以上结果表明，2 mL试验组有1头仔猪，首免和二次免疫后1天注射部位出现稍稍发红，第2天症状完全消失，恢复正常，其他试验猪均表现正常。由此可见，4种免疫剂量的试验猪2次免疫后注射部位均表现正常，没有出现严重的不良反应，证明该疫苗对仔猪安全。

根据以上注射部位的肌肉组织病理切片图显示，仔猪在接种疫苗后，注射部位的肌肉组织均保持较好的细胞组织形态，没有出现严重的炎性反应。

3.3 攻毒前后体重变化情况

在试验期间的不同时间节点，对仔猪进行了称重，以测定不同免疫剂量对仔猪经济指标的影响，如表2所示。

表2 不同剂量猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）免疫攻毒试验中仔猪体重结果

以上结果表明，免疫试验期间各组仔猪的体重增加差别不明显，但免疫攻毒后差异较为显著，免疫组增重明显高于对照组，对照组个别猪还出现了体重稍有下降的情况。

3.4 免疫效力结果

根据剖检后猪肺脏发生Mhp感染的病变情况，使用5.5分法进行评分和计算，结果详见表3。

表3 免疫攻毒试验中仔猪的肺脏病变计分情况及各组的保护效力情况

以上结果显示，免疫组的仔猪肺部病变情况较对照组有明显改善，而且随着免疫剂量的增加，免疫攻毒保护效力也明显增加，按照60%的保护率为合格标准，猪支原体肺炎灭活疫苗（S株）对7～14日龄仔猪的最小免疫剂量定为0.5 mL/头，推荐使用剂量为1.0 mL/头。

4 结论

本研究通过对猪肺炎支原体灭活疫苗 (S株)以2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、和 0.25 mL 四种剂量两次免疫健康仔猪，整个试验期间四个免疫剂量组的仔猪体温均未出现明显的变化，注射部位也没有出现严重的不良反应，表明该疫苗对仔猪安全。攻毒保护率结果分别为77.9%、70.5%、65.3%、49.5%，按照60%以上即达到标准，该疫苗对7～14日龄仔猪的最小免疫计量可定为0.5 mL/头，以最小免疫剂量的双倍剂量作为推荐使用剂量，即1.0 mL/头。该试验为后续猪肺炎支原体灭活疫苗的研究奠定了基础。