基于整合药理学平台预测前列腺1号方治疗慢性前列腺炎作用机制

张天宇，刘 嘉，杨 凯，曾明月，董盼攀，曾庆琪

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.江苏卫生健康职业学院，江苏 南京 210029；3.张家港市中医医院，江苏 张家港 215600；4.北京中医药大学，北京 100029；5.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012）

前列腺1号方是曾庆琪教授治疗慢性前列腺炎（chronic prostatitis,CP）的经验方，动物实验表明可抗炎[1]，临床研究也证明具有较高安全性和满意的疗效[2]。药物组成包括绵萆薢、菟丝子、茯苓、石菖蒲、马鞭草、威灵仙、白芷、延胡索，可益肾化湿、泄浊通络，但其药理机制尚不明确。

网络药理学能够构建“疾病‑表型‑基因‑药物”多层次网络，打破了常规中药方剂单一成分、通路研究思路，从整体角度探索药物与疾病的作用机理，与中医药整体观、辨证论治等原则吻合[3,4]。中医药整合药理学研究平台（TCMIP）V 2.0，是一个智能化中医药数据挖掘平台，信息来源于中医药百科全书（ETCM）[5]。本研究主要应用整合药理学预测前列腺1号方治疗慢性前列腺炎的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 获取化学成分

本研究应用中医药整合药理学研究平台（TC‑MIP，http：//www.tcmip.cn/）中药材数据库，将前列腺1号方药物组成的每味药依次设定为关键词，收集相应化学成分。根据化学成分数据库基于体内ADME过程提供的化学成分信息，以Druglike‑ness Weight>0.46为标准筛选出中高度类药性化学成分，建立前列腺1号方的有效化学成分数据库。

1.2 筛选预测靶标

利用中药成分数据库或中药（含方剂）靶标预测功能，将前列腺1号方的化学成分或方药组成设定为关键词，检索出候选靶标，以相似性分数大于等于0.8（score≥0.8）为标准筛选出预测靶标，建立前列腺1号方的潜在靶标数据库。TCMIP平台基于OpenBabel软件的MACCS分子指纹提取功能，参考DrugBank比对分析化学成分的二维结构，选取Tanimoto系数相似性分数大于等于0.8的候选靶标［6］。

1.3 查询疾病靶标

运用疾病相关分子库，将“前列腺炎”设定为关键词查询疾病靶标，建立慢性前列腺炎的疾病靶标数据库。疾病靶标来源于Human Phenotype Ontol‑ogy数据库（HPO，http：//humanphenotypeontology.github.io/）。

1.4 建立蛋白质相互作用网络

蛋白质相互作用（PPI）是生物分子网络的基本组成单位，也是连接方药靶标与疾病靶标之间纽带，更是疾病发生的重要环节。TCMIP平台整合了以下8个数据库的PPI数据信息：Half A Degree Additional Warming（HAPPI）、Reactome Pathway Database（Reactome）、IntAct Molecular Interaction Database（InAct）、Online Predicted Human Interac‑tion Database（OPHID）、Molecular Interaction Data‑base（MINT）、Human Protein Reference Database（HPRD）、Database of Interacting Protein（DIP）、PDZBase等。故本研究使用TCMIP平台，直接获取前列腺1号方的潜在靶标与慢性前列腺炎疾病靶标的蛋白质相互作用网络关系。

1.5 挖掘中医药关联网络

通过TCMIP平台的网络分析模块，构建前列腺1号方的潜在靶标与慢性前列腺炎疾病靶标之间的PPI计算网络特征值，将“节点连接度（degree）”的2倍中位数设为卡值，选取中药靶标‑疾病‑基因互作网络的核心节点（hubs）；再将“degree”、“节点紧密度（closeness）”和“节点介度（betweenness）”的中位数设为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为前列腺1号方治疗慢性前列腺炎的关键靶标网络节点。通过对关键靶标网络的基因功能和通路富集分析，构建前列腺1号方调控机制的“方剂‑中药材‑成分‑核心靶标‑通路‑疾病”可视化多维关联网络及“方药构靶”核心网络。

1.6 分析基因功能和富集通路

TCMIP平台包括GO基因本体数据库（http：//www.geneontology.org）和KEGG通路库（http：//www.genome.jp/kegg/）资源，故可直接获得生物学反应、作用通路等信息。应用富集计算，进行基因功能和通路富集分析，绘制气泡图，预测前列腺1号方治疗慢性前列腺炎的潜在作用机制。

2 结果

2.1 前列腺1号方的有效化学成分及预测靶标

前列腺1号方在TCMIP平台共有220个化学成分，根据类药性筛选出103个有效化学成分（100种有效化学成分），其中绵萆薢3种、菟丝子3种、石菖蒲18种、茯苓9种、威灵仙5种、白芷33种、败酱草2种、延胡索30种。根据相似性分数筛选出1 314个预测靶标（692种预测靶标），其中重复频次较高的有29种靶标，AR出现7次，NR1I2、NCOA 1、GA‑BRG3、GABRG2、GABRG1、GABRB3、GABRA 6、GABRA 5、GABRA 4、GABRA 3、GABRA 2、GA‑BRA 1等13个靶标均出现5次，VDR、SHBG、PIM 1、NR3C1、NFKB2、NFKB1、HSD11B2、HSD11B1、GLTP、ESR2、ESR1、cobT、ADK、AB‑CB1等15个靶标均出现4次。

通过对前列腺炎1号方潜在靶标进行基因功能分析和通路富集分析，取显著性排名前20（图1、2）。气泡颜色代表P值，反映富集显著性；气泡大小代表基因数，反映富集到的基因数量大小。前列腺1号方药理作用多集中在突触传递、离子转运、神经元动作电位、受体激活、受体转录等方面，参与生物学反应主要是神经系统过程、离子跨膜运输、化学突触传递，参与通路多涉及核受体转录途径、GABA A受体激活、GABA受体激活。

图1 前列腺1号方预测靶标基因生物学反应气泡图Fig 1 Bubble diagram of biological process of target gene of prostate prescriptionⅠ

图2 前列腺1号方预测靶标基因参与通路气泡图Fig 2 Bubble diagram of reactome pathway of target gene of prostate prescriptionⅠ

2.2 前列腺1号方治疗慢性前列腺炎的关键靶标网络

借助TCMIP平台的网络分析模块，建立前列腺1号方治疗慢性前列腺炎的关键靶标网络，筛选出关键靶标89个，按照degree值大小显示所有关键靶标，图3中节点大小与degree值成正比，包括33个核心节点、6个直接作用疾病靶标的节点（其中LCK对4个疾病靶标均有直接作用）。33个核心节点的网络关系通过图4显示，6个直接作用疾病靶标节点分别是LCK、PTK2B、AKT 1、INS、PIK3R1、ATP5C。

图3 前列腺1号方治疗慢性前列腺炎关键靶标网络图Fig 3 Core target network diagram of prostate prescriptionⅠin the treatment of chronic prostatitis

图4 前列腺1号方治疗慢性前列腺炎核心节点网络图Fig 4 Core node networ k diagram of pr ostate pr escriptionⅠin the treatment of chronic prostatitis

2.3 基因功能和通路富集分析结果

借助TCMIP平台GO、KEGG数据库，前列腺1号方治疗CP的预测靶标基因功能和通路富集结果显示如下（前20，图5、6）。前列腺1号方治疗CP的药理机制集中在神经受体、受体信号通路、信号转导等方面，参与生物学反应主要是对药物的应答、G蛋白偶联受体信号通路，偶联到环核苷酸第二信使、信号转导，参与通路多涉及5‑羟色胺受体、多巴胺受体、Gα（Ⅰ）信号事件。

图5 前列腺1号方治疗CP的预测靶标基因生物学反应气泡图Fig 5 Bubble diagram of biological process of target gene of prostate prescriptionⅠin the treatment of CP

2.4“中药材‑成分‑核心靶标‑通路”可视化多维关联网络

应用TCMIP平台中医药关联网络挖掘功能，在“自定义多维关联网络可视化”中选择“中药材”、“成分”、“核心靶标”、“通路”、“疾病”，构建可视化多维关联网络。前列腺1号方通过8味中药、79个有效化学成分、33个核心靶标、11条通路发挥治疗慢性前列腺炎的药理作用。推测前列腺1号方对CP的干预作用主要与5‑羟色胺受体、多巴胺受体、Gα（I）信号通路、Gα（Q）信号通路、TP53调节代谢基因、呼吸电子传递、PI3K/AKT信号的调节、CD28依赖性PI3K/AKT信号、Ik BA变异产生EDA‑ID、PIP3激活AKT信号、下游TCR3信号等有关。见图7。

图6 前列腺1号方治疗CP的预测靶标基因参与通路气泡图Fig 6 Bubble diagram of reactome pathway of target gene of prostate prescriptionⅠin the treatment of CP

图7“中药材‑成分‑核心靶标‑通路”可视化多维关联网络图Fig 7 Visual multi⁃dimensional correlation network diagram of"herb⁃ingredient⁃core target⁃pathway"

3 讨论

前列腺1号方含有丰富有效的化学成分，作用靶点多样，参与通路各异，既平行又交叉地共同作用发挥实际功效。本研究采用整合药理学研究方法挖掘前列腺1号方，预测其发挥治疗作用的潜在药理机制。

前列腺1号方是在经验方基础上增加延胡索而成。延胡索有抗菌抗炎、镇痛等药理作用［7］。干预CP有效化学成分有79种，核心作用靶标有LCK、PTK 2B、AKT 1、INS、PIK 3R1、HSP90AA 1、NR3C1、PIK 3CA、CREB1、ADCY 1、AR等33个。其中，LCK、PTK2B、AKT 1、INS、PIK 3R1、ATP5C等6个靶标是直接作用疾病的。文献研究表明，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）是调节T细胞功能、参与T细胞信号转导的关键靶点，在类风湿关节炎、过敏性鼻炎及癌症等多种炎症和免疫性疾病发病机制中发挥重要作用［8，9］；PTK 2B、AKT 1参与神经传递和中枢神经系统信号通路［10］；PIK 3R1是PI3K主要调控亚型，PI3K/Akt通路及其下游靶点成为巨噬细胞活化表型的中心调控因子，此通路的激活是限制促炎的关键，Akt调节巨噬细胞，包括促进抗炎细胞因子的产生、吞噬、自噬并维持内稳态［11］。

中医药关联网络挖掘发现前列腺1号干预CP的信号通路主要包括serotonin receptors、dopamine receptors、G alpha（i）signalling events、G alpha（q）signalling events、TP53 regulates metabolic genes、re‑spiratory electron transport、PI5P，PP2A and IER3 regulate PI3K/AKT signaling、CD28 dependent PI3K/AKT signaling、IKBA variant leads to EDA‑ID、PIP3 activates AKT signaling、down‑stream TCR signaling等。文献检索各通路，整理分析如下：PI3K/AKT信号通路在细胞生长、血管生成、代谢调节、炎症等方面发挥重要作用［12，13］，另外此通路还与结肠炎炎症相关［14］，PI5P控制胰岛素信号并通过调节磷酸酶来激活蛋白激酶B（AKT）［15］，激活PP2A可阻断PI3K、Akt和ERK磷酸化［16］；早期反应基因IER3与炎症和免疫调节有关［17］；T细胞共刺激分子（CD28）激活1A类磷酸肌醇激酶（PI3K）［18］，磷脂PIP3可调控Akt的生化和结构［19］；5‑羟色胺受体是一种神经递质受体，在心血管、胃肠、内分泌中枢神经及行为功能发挥生理作用，在前列腺等组织中高水平表达［20］；神经系统、内分泌系统和免疫系统的不平衡导致大脑到前列腺传递信号改变引起炎症，多巴胺受体（D1/D2平衡）参与调节排尿反射［21，22］；G（i）是活性氧靶蛋白，通过氧化应激参与细胞信号通路，G（q）参与免疫细胞信号通路［23，24］；TP53是肿瘤抑制基因，和前 列腺癌 有关。线粒体呼吸电子链参与前列腺组织的氧代谢［25］；T细胞受体参与炎症和适应性免疫［26］。故前列腺1号对CP的干预治疗可能体现在抗炎抗肿瘤、细胞代谢、免疫调节、神经调节等方面。

综上所述，本研究应用中医药整合药理学研究方法，对前列腺1号治疗CP的潜在作用机制进行数据挖掘和网络研究，结果显示前列腺1号方中79种有效化学成分可能通过11条信号通路作用于33个关键靶标发挥抗炎抗肿瘤、细胞代谢、免疫调节、神经调节等作用，为经验方治疗CP提供理论依据和药理阐释。本研究填补了经验方研究中除理论传承、动物实验和临床试验外空白，实现中医药研究现代化，以期指导临床应用。但因整合药理学研究离不开数据库完整性及实时性，中医方剂并非单一中药药理简单相加，故此类研究仍有局限性，亟待优化和进一步探索。