灵芝菌种低温保藏保护剂配方研究

王晓敏， 曾 茜， 魏善元， 陈 旭

(1.贵州省农业科学院土壤肥料研究所， 贵阳 550006；2.贵州中医药大学 基础医学院， 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院农作物品种资源研究所， 贵阳 550006)

灵芝(Ganodermalucidum)是著名的食药用菌，是我国传统中药之一，在我国广泛栽培[1-2]。目前，国内灵芝菌种市场混乱，存在菌种活性退化、品质差等问题[3-4]。栽培过程中由于菌种保藏条件的限制，一些菌种的优良性状无法长期有效保存，或者因为保藏方法成本相对昂贵而不能广泛应用到生产中[5]。

目前食用菌菌种保存大多采用试管斜面保藏或液氮保藏等方式进行。试管斜面保藏周期短且菌种活性易退化，液氮保藏可较好维持菌种活性，但维护成本高[6]。农户由于缺乏良好的菌种保藏设备，长期依赖购买菌种，增加了栽培成本。因此，探究高效廉价且贴合农户实际生产条件的灵芝菌种保藏方式十分必要。目前，食用菌菌种-20 ℃低温保藏工艺已在真姬菇等4种食用菌菌种的保藏试验中进行研究应用。灵芝菌种的-20 ℃低温保藏缺乏相关研究，-20 ℃低温保藏法原理类似于液氮超低温冷藏法，但其保藏成本和对保藏条件的要求远低于液氮冷藏。通过在冻存管中添加保护剂的方法对灵芝菌种进行-20 ℃液体管冷冻保藏，可为灵芝菌种提供新的保藏方法，不仅能维持菌种活性，且成本低、方便操作，易推广。

本研究通过Design Expert软件采用Plackett-Burman和 Box-Behnken试验设计，筛选适宜的灵芝母种-20 ℃低温保护剂优化配方，从而达到降低灵芝菌种维护成本，提高灵芝菌种质量的目的，也为栽培灵芝的生产者提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌株

灵芝菌种QL 02由贵州省土壤肥料研究所提供。

1.1.2试 剂

葡萄糖、琼脂、二甲基亚砜、丙三醇、甲醇、蔗糖、聚乙二醇均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1菌丝活性测定

以菌落直径法[7]为主要评价指标，将待测菌株接种在PDA平板培养基上于25 ℃环境中避光培养约6 d，将平板上已活化的菌丝用打孔器进行打孔，取圆形菌块，放入不同编码保护剂的冻存管中，-20 ℃低温保藏3个月，取出冻存管中的菌块，接种于PDA培养基中，25 ℃避光培养6 d，测量其菌丝平均生长速度[4]。

1.2.2筛选影响菌丝活性的关键因素

以-20 ℃冻存管菌种保护剂配方中的二甲基亚砜、丙三醇、甲醇、蔗糖、聚乙二醇含量为主要因素，进行Plackett-Burman筛选试验，考察对-20 ℃保存后菌丝活性有显著影响的因素。每个因素取最低(-1)和最高(1) 两个水平，见表1。

表1 Plackett-Burman 试验设计的因素水平表和编码

1.2.3响应面优化实验设计

根据1.2.2关键因素筛选试验结果，选取丙三醇、甲醇、蔗糖3个因素，进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计(见表2)，每个因素分别取低水平(-1)、中水平(0)和高水平(1)三个水平。对Box-Behnken 试验设计结果建立数学回归模型并分析。

表2 Box-Behnken试验设计的因素水平表和编码

1.2.4数据分析

本研究采用Excel软件进行数据统计分析；采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面结果分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果及分析

对表3中的数据进行多元回归分析，得到菌丝生长速率为响应值的最优方程为Y=2.53+0.48X1+0.13X2-0.38X3+0.79X4+0.38X5。且得到各因素效应评价，结果见表4。

表3 Plackett-Burman 试验设计及响应值

根据效应值的大小可知，影响菌丝生长速度的关键因素依次为：X4(蔗糖)>X1(丙三醇)>X3(甲醇)>X5(聚乙二醇)>X2(二甲基亚砜)，见表4。其中X4(蔗糖)对菌丝生长速度 的影响达到极其显著水平(p<0.01)，X1(丙三醇)和X3(甲醇)则达到显著水平(p<0.05)，而X5(聚乙二醇)和X2(二甲基亚砜)影响不显著。故选择X4(蔗糖)、X1(丙三醇)和X3(甲醇)3个关键因素进一步做响应面优化设计和分析。

表4 Plackett-Burman 试验设计各因素效应

2.2 响应面试验结果及分析

采用Design-Expert软件对表5中的实验数据进行分析，获菌丝生长速度(Y)对蔗糖(A)、甲醇(B)和丙三醇(C)的二次多项回归方程：

表5 Box-Behnken 试验设计及结果

Y=5.18+0.44A+0.25B+0.32C-0.25AB+0.15AC+0.23BC-0.57A2-0.30B2-0.68C2

进一步对回归模型进行方差分析，结果见表6。由表6可知，该回归模型p<0.01(极显著)，失拟项p>0.05(不显著)，说明该模型可以用于-20 ℃保藏条件下提高菌丝活性配方的优化。另外，模型的决定系数R2=0.932 6，说明拟合程度良好；校正决定系数R2Adj=0.845 9，故实际值与预测值相关性较高。表明该回归模型可用于-20 ℃保藏条件下菌丝活性的分析和预测。经方差分析可知，3个因素对菌丝活性影响的顺序为：A>C>B，即蔗糖>丙三醇>甲醇，其中蔗糖作为保护剂含量对菌丝活性的影响极显著(p<0.01)，丙三醇和甲醇对菌丝活性的影响显著(p<0.05)；交互项AB，AC，BC均不显著；A、B、C的显著性水平与Plackett-Burman试验结果一致。

表6 回归模型方差分析结果

优化后的最优配方为：蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%。菌丝生长速度理论值为5.25 mm·d-1。

2.3 优化条件下菌丝生长速率验证

对响应面法所得最优配方的可靠性进行验证，按照蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%的配方配置保护剂溶液，进行3次平行试验，-20 ℃保存3个月后最终测得菌丝生长速度为5.13 mm·d-1。

3 结 论

通过关键因素筛选试验，筛选获得保护剂中蔗糖含量、丙三醇含量、甲醇含量这3个影响-20 ℃低温保藏灵芝菌株QL 02菌丝活性的关键因素。再通过响应面优化试验设计得到参数为蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%的最优保护剂溶液配方，菌丝生长速度理论值为5.25 mm·d-1。经过实验验证后，在此最优条件下，QL 02菌丝生长速率为5.13 mm·d-1，与所得模型预测值(5.25 mm·d-1)较为一致，表明该回归模型合理可靠，具有一定的实用价值，为灵芝的-20 ℃低温保藏保护剂配方优化提供参考。