神经干细胞联合神经生长因子纳米粒海马移植对阿尔茨海默病转基因鼠的影响

朱 清，邵 帅，胡 楠，陈 艳*

1广州医科大学附属第二医院，广东 广州510260；

2荆门市第二人民医院，湖北 荆门448000

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种起病隐匿且进行性进展的神经系统退行性疾病。有研究显示，早在β-淀粉样蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）沉积之前，AD患者脑内已存在胆碱能神经元受损和基底前脑胆碱能神经元的损伤，导致支配海马和皮层胆碱能纤维减少，这是引起AD患者认知功能减退最重要的原因［1］。研究表明，神经干细胞（neural stem cell，NSC）移植可通过不同的机制改善AD模型鼠的认知功能。但是，外源性NSC移植到脑内的存活率及其分化命运无法掌控。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是一种重要的神经营养因子，其可影响体内外正常NSC甚至AD脑内异常NSC的存活、增殖和分化［2］，并在胆碱能神经元表型的维持上发挥不可替代的作用［3］。但NGF作为一种大分子蛋白质，无法透过血脑屏障，半衰期短，其在脑内的应用具有一定局限性。本课题组前期研究结果显示，联合NGF纳米粒移植可促进移植NSC存活，增加海马突触素（synaptophysin，SYP）的表达，最终改善AD小鼠的认知功能［4］。本研究采用复乳化溶剂扩散法制备NGF纳米粒，改变NGF的膜转运机制，使其可以透过血脑屏障，通过NGF纳米粒联合NSC移植治疗APP／PS1转基因AD小鼠，观察移植细胞的存活和分化，探讨NSC移植对基底前脑胆碱能神经元及海马、皮层Aβ斑块的影响，为分析细胞移植治疗AD小鼠认知功能障碍可能的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5月龄SPF级雄性APP／PS1转基因AD小鼠45只，体质量25～35 g，购自广东省实验动物中心及南京生物医药研究所［许可证号：SCXK（粤）2013-0002；SCXK（苏）2015-0001］。购买后用普通饲料饲养至12月龄，饲养过程中因疾病等原因淘汰9只，最终纳入36只。5月龄SPF级雄性野生型小鼠（wild type，WT）16只，购自广州中医药大学实验动物中心［许可证号SCXK（粤）2013-0034］，饲养至12月龄，选12只纳入本研究。广泛表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）C57BL／6-转基因雌性小鼠3只，购自南京大学-南京生物医药研究院［许可证号：SCXK（苏）2015-0001］，购回后交配育种，取孕12.5～14.5 d的胎鼠脑提取NSC。

1.2 实验试剂

杜氏改良培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM／F12）、B27添加剂、神经基础培养基（Neurobasal）（美国Gibco公司）；青-链霉素溶液（美国Sigma公司）；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、NGF（美国PeproTech公司）；硫磺素T试剂（美国Sigma公司）；RT-PCR反转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒（Takara公司）；鼠抗胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）一抗（Affinity Biosciences公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（博奥森生物科技公司）；鼠抗β-tubulinⅢ一抗、鼠抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体、鼠ChAT抗体（Abcam公司）；兔抗双肾上腺皮质激素（doublecortin，DCX）抗体（Cell Signaling Technology公司）；羊抗小鼠Alexa FluorTM568、驴抗兔Alexa FluorTM594（Thermo Fisher公司）。所用引物由Invitrogen公司合成，引物序列为：①βactin：上游5'-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3'，下游3'-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-5'。②Lhx8：上游5'-ACACGAGCTGCTACATTAAGGA-3'，下游3'-CCAGTCAGTCGAGTGGATGTG-5'。③ChAT：上游5'-GGCCATTGTGAAGCGGTTTG-3'，下游3'-GC CAGGCGGTTGTTTAGATACA-5'。

1.3 实验动物分组

36只12月龄雄性APP／PS1转基因小鼠采用随机数字表法分为AD对照组、NSC移植组、NSC联合NGF纳米粒移植组（联合移植组），每组12只。另外选取12只12月龄雄性野生型小鼠作为WT对照组。

1.4 实验方法

1.4.1 NSC分离及培养

1.4.1.1 NSC分离 孕12.5～14.5 d的EGFP转基因小鼠麻醉后断颈处死，取出Y型子宫转到无菌环境，依次放置于75%酒精、D-Hanks平衡盐中清洗2次，随即于预冷的平衡盐液中剥出胎鼠大脑，小心剥离脑膜及血管（冰上操作），将剥离干净的脑组织转入另一预冷DMEM／F12培养液中，剪碎并吹打，经200目无菌滤网过滤后离心5 min，收集细胞（1 000 r／min）。

1.4.1.2 NSC培养DMEM／F12培养液清洗收集细胞，离心后去除上清，加入新鲜配制的神经干细胞增殖培养基（DMEM／F12基础培养液＋2% B27＋20 ng／mL EGF＋20 ng／mL bFGF＋1%青链霉素），吹打混匀计数，调整细胞浓度为1×105／mL，接种于25 mL培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。根据细胞生长状态2～3 d半量换液，5～6 d传代，据传代次数依次记为P1、P2代。

1.4.2 NSC移植 根据小鼠脑立体定位图谱，确定双侧海马注射点并做标记：前囟后2.05 mm，旁开1.85 mm，深度2.5 mm。具体移植步骤如下：WT对照组和AD对照组小鼠于双侧海马注射5 μL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），NSC移植组注射5 μL NSC悬液（PBS制备1×105／μL NSC细胞悬液），联合移植组注射5 μL NSC和NGF纳米粒悬液（50 ng／mL的NGF纳米粒溶液重悬，配制1×105／μL NSC悬液）［5］。移植术后，各组小鼠单笼饲养，自由进食饮水。

1.5 样本采集

1.5.1 脑切片采集 移植术后4周，每组随机取6只小鼠灌注取脑行组织切片染色。腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，并固定四肢，充分暴露心脏，快速灌注预冷的0.9% NaCl溶液，再灌注预冷的4%多聚甲醛，断头取脑，将脑组织置于4%的多聚甲醛中后固定（4℃，16 h），之后分别在10%、20%、30%的蔗糖溶液中进行梯度脱水，脱水完全的脑组织用OCT包埋剂包埋并快速冰冻后切片，片厚30 μm，放入组织冻存液中保存，用于免疫荧光及硫磺素染色。

1.5.2 脑组织采集 移植术后4周，每组随机取6只小鼠，颈椎脱臼法快速处死小鼠，取脑，分离出双侧基底前脑，一侧置于含Trizol的EP管中，用于RNA检测；另一侧置于蛋白裂解液中（-80℃保存），用于蛋白表达的检测。

1.6 观察指标

1.6.1 免疫荧光法检测NSC存活、迁移、分化及基底前脑ChAT水平 选取海马及基底前脑部位脑组织切片，PBS洗3次（5 min／次），0.3% Triton-X100室温孵育15 min后用PBS洗3次（5 min／次）；5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室温封闭2 h，吸弃BSA封闭液后，海马脑切片中加入GFAP、DCX一抗工作液，基底前脑部位切片加入ChAT一抗工作液，4℃孵育过夜（约14 h），次日取出，用PBS彻底洗净抗体后，加入相对应荧光二抗工作液，室温孵育1.5 h，避光处理，PBS洗3次（10 min／次）后将脑片平铺在载玻片上，滴加抗荧光衰减封片剂［含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）］，荧光显微镜下观察并拍照。

1.6.2 实时荧光定量PCR法检测基底前脑ChAT和LIM同源盒基因8 mRNA表达 采用Trizol法提取脑组织RNA，并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）测各组基底前脑ChAT和LIM同源盒基因8(LIM homeobox8,Lhx8)mRNA浓度。

1.6.2.1 RNA逆转录为cDNA①反应体系如下：5×Prime Script Buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Prime 1 μL，Random 6 mers 1 μL、RNA 1 μg，RNase Free H2O up to 20 μL。②反转录条件：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min，完成后置于-80℃保存。

1.6.2.2 实时荧光定量PCR①反应体系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，共20 μL。②采用ABI7500仪器进行检测。按以下步骤进行扩增：预变性95℃30 s；95℃5 s、60℃34 s，共40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。以β-actin为内参基因，使用比较阈值法分析目的基因ChAT和Lhx8相对表达量。相对表达量（Relative quantity，RQ）的计算公式为：RQ值＝2-△△CT，△△CT＝（CT实验组目的基因－CT实验组内参基因）－（CT对照组目的基因－CT对照组内参基因）。

1.6.3 Western blot法检测基底前脑ChAT蛋白表达 取出置于-80℃保存的基底前脑组织（含有蛋白裂解液），冰上溶解后提取总蛋白并检测浓度，将各组蛋白样品调成相同的浓度。蛋白经高温变性后检测各组蛋白含量。①聚丙烯酰胺凝胶电泳：按照配方配制10%分离胶和5%浓缩胶，各组取等量蛋白样品加入电泳槽中浓缩胶样本孔内，80 V电泳120 min。②转膜：将蛋白转印于聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，276 mA恒流，转膜100 min。③免疫反应：5%脱脂奶粉封闭1～2 h，TBST缓冲液洗膜后加入ChAT抗体工作液，4℃孵育过夜，次日取出洗净一抗后加入相应的二抗，室温孵育1 h，洗净残留抗体，加入显影剂后放入GeneGnome成像分析系统检测蛋白条带。

1.6.4 硫磺素T染色检测海马及皮层淀粉样斑块数量 从组织冻存液中挑出海马及皮层部位脑片，PBS溶液中清洗3次，5 min／次，将脑片平整黏附于玻片上，待干燥后，苏木素染色5～10 min，自来水冲洗3次，5 min／次；1%硫磺素T染色5～10 min，自来水冲洗15 min；80%乙醇分色数秒，阴干避光封片。荧光显微镜在DAPI激发光下检测各组海马及皮层Aβ斑块的数量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，数据采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐用校正t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 移植的EGFP阳性NSC在体内的存活、迁移及分化情况

移植4周后，NSC移植组和联合移植组免疫荧光下均可见移植NSC存活，并向广泛的脑区迁移，包括胼胝体远端、皮层以及海马深部。联合移植组存活细胞更多，且NSC显示了粗大的突起。见图1。在海马齿状回中，联合移植组的NSC有更多类似于成熟颗粒细胞形态的细胞，2组移植的NSC均可表达阳性GFAP和阳性DCX。见图2。移植4周后，NSC移植组和联合移植组GFAP阳性细胞分化率、DCX阳性细胞分化率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 2组胶质细胞及神经元分化率比较（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

表1 2组胶质细胞及神经元分化率比较（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

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图1 2组移植神经干细胞的存活与迁移（×100）Figure 1 Survival and migration of neural stem cells in vivo between two groups（×100）

图2 2组移植神经干细胞分化（×200）Figure 2 Differentiation of neural stem cells in vivo between two groups（×200）

2.2 NSC联合NGF纳米粒移植治疗对APP／PS1转基因鼠基底前脑胆碱能神经元的影响

2.2.1 ChAT神经元细胞数量 结果显示，NSC移植组及联合移植组基底前脑区均未见到EGFP阳性NSC。与AD对照组比较，NSC移植组及联合移植组移植4周后，ChAT神经元细胞数量明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与WT对照组比较，NSC移植组ChAT神经元细胞数量虽有所增加但仍明显较低，差异具有统计学意义（P＜0.05），而联合移植组ChAT神经元细胞数量则无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表2。

图3 4组基底前脑胆碱能神经元数量（×200）Figure 3 The number of cholinergic neurons in the basal forebrain in four groups（×200）

表2 4组基底前脑ChAT阳性神经元数量比较Table 2 Comparison of the number of ChAT neurons in basal forebrain in four groups

2.2.2 ChAT蛋白水平表达 结果显示，与AD对照组比较，NSC移植组及联合移植组基底前脑ChAT蛋白水平明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与WT对照组比较，NSC移植组与联合移植组基底前脑ChAT蛋白水平明显降低，而NSC移植组与联合移植组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

2.2.3 ChAT基因及其转录因子Lhx8基因表达 结果显示，与AD对照组比较，NSC移植组及联合移植组ChAT和Lhx8基因表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。与WT对照组比较，NSC移植组ChAT和Lhx8基因表达虽有所增加但仍明显低于WT对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与NSC移植组比较，联合移植组ChAT和Lhx8基因表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 基底前脑ChAT蛋白及ChAT、Lhx8基因表达Figure 4 Expression of ChAT protein and the gene level of ChAT／Lhx8 in the basal forebrain

2.3 NSC联合NGF纳米粒移植对APP／PS1转基因鼠海马及皮层Aβ斑块的影响

采用硫磺素T染色检测海马及皮层Aβ斑块数量的变化，结果显示，WT对照组小鼠脑内无Aβ斑块沉积，而AD转基因鼠海马及皮层有大量Aβ斑块沉积。与AD对照组比较，NSC移植组、联合移植组皮层及海马Aβ斑块数量虽有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。与NSC移植组比较，联合移植组皮层及海马Aβ斑块数量无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 4组海马及皮层Aβ斑块数量比较（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

表3 4组海马及皮层Aβ斑块数量比较（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

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图5 海马及皮层Aβ斑块染色数量比较（×100）Figure 5 Number of Aβ plaques in the hippocampus and cortex（×100）

3 讨 论

研究显示，AD中存在广泛的胆碱能功能的退化和神经营养因子缺乏［6］，甚至早在Aβ沉积之前就可能存在胆碱能功能障碍。NGF在神经元存活、分化、成熟以及突触生长中起重要作用［7-8］，且对基底前脑胆碱能神经元表型的维持起着不可替代的作用［9］。基底前脑作为脑内最大的胆碱能神经元核团，主要投射区包括海马、皮层、杏仁核和嗅球。本研究采用NSC联合NGF纳米粒移植干预APP／PS1转基因AD小鼠，观察移植NSC存活、迁移及分化情况，以及联合移植对基底前脑胆碱能神经元及Aβ斑块的影响，探讨NSC联合NGF纳米粒海马移植是否对基底前脑胆碱能神经元起到直接替代或间接保护作用。

3.1 NSC联合NGF纳米粒移植可促进NSC存活及迁移

本研究结果显示，与NSC移植组比较，联合移植组NSC存活数量明显增加，且NSC具有复杂突起形态。这提示联合移植组可能通过NGF纳米粒缓慢释放NGF，发挥对NSC的保护作用以及促进NSC突起生长。这与本课题组前期研究发现，NSC联合NGF纳米粒移植可能通过缓慢释放NGF，提高突触前蛋白（SYP）蛋白水平，进而改善AD鼠学习记忆功能的结果一致［5］。其可能的机制是NGF可被突触末端摄取，经逆行转运至胞体，与其功能性受体TrKA结合，促进NSC分化及成熟，促进海马突触重建［10］。此外，本研究采用GFAP、DCX分别对胶质细胞及早期神经元进行标记，结果显示NSC移植组和联合移植组的分化率差异无统计学意义，但联合移植组中NSC有粗大突起及形态改变。这提示，使移植的细胞分化成目标神经元，然后投射到适当的区域，与机体建立功能联系是相当困难的，这与MARSH等［11］认为“神经替代作用要比预期复杂”的观点相似。因此，本课题组认为NGF诱导移植NSC在脑内定向分化具有挑战性，NSC移植促进AD小鼠认知功能恢复的作用机制可能与神经替代作用无关。

3.2 NSC联合NGF纳米粒移植增强基底前脑胆碱能功能

有研究显示，AD中基底前脑胆碱能神经元处于受损及萎缩状态［11］，NGF对胆碱能神经元表型的维持不可缺少，而AD中存在严重的神经营养因子缺乏。本研究结果显示，NSC移植组及联合移植组基底前脑区并无EGFP标记的NSC，与AD对照组比较，NSC移植组及联合移植组ChAT阳性细胞数明显增加，且ChAT蛋白相对表达量也明显增加。这提示，NSC海马移植可以间接补充基底前脑胆碱能神经元。NSC移植可能通过释放神经营养因子保护基底前脑胆碱能神经元，NSC释放的营养因子经逆行转运，营养神经元胞体，间接修复受损的神经元，并非细胞的直接替代作用，这与BLURTON-JONES等［12］观点相似。NSC联合NGF纳米粒移植可能通过缓慢释放NGF，NGF既可保护移植的NSC又可被转运营养神经元胞体。此外，NSC移植组及联合移植组中ChAT及其转录因子Lhx8基因表达均明显增加，与NSC移植组比较，联合移植组增加明显更多。这提示，NSC联合NGF纳米粒移植可促进ChAT及Lhx8基因的表达，LIM同源域家族Lhx8基因可作为NGF诱导胆碱能表型维持的调节器，这种调节与ERK信号通路有关［11，13］。这提示了NGF纳米粒可能通过缓释NGF，调控Lhx8基因促进ChAT表达，从而保护基底前脑胆碱能神经元。

3.3 NSC联合NGF纳米粒移植不能减轻AD脑内Aβ斑块沉积

Aβ级联假说作为AD经典病理假说之一，该假说认为Aβ具有神经毒性，可引起神经纤维缠结、血管损伤、神经元丢失等一系列病理改变［14］。APP／PS1转基因小鼠是常用的AD动物模型，该双转基因小鼠能够较好地模拟AD的病理和行为学特征，如Aβ斑块沉积及认知能力下降［15-16］。本研究中采用硫磺素染色检测移植4周后各组小鼠海马和皮层Aβ斑块负荷，结果显示，12月龄APP／PS1转基因AD小鼠海马和皮层存在大量的Aβ斑块沉积，而NSC移植及联合NGF纳米粒移植均不能有效减轻Aβ斑块 沉 积。这 与ZHANG等［17］研 究 认 为 小 鼠 来 源 的NSC移植并不能改善APP／PS1转基因小鼠Aβ斑块沉积的结果相似。但也有部分研究认为，使用人来源NSC和人来源的间充质干细胞移植治疗AD模型鼠可以显著减少AD脑内的Aβ斑块沉积［18］，这可能与高级物种来源的干细胞可对低级物种发挥更大的治疗作用有关。本研究尚不能证实NSC移植促进AD小鼠认知功能改善与降低Aβ斑块沉积有关。

4 小 结

NSC联合NGF纳米粒移植可以间接保护基底前脑胆碱能神经元，保护NSC的存活和成熟，并促进基底前脑ChAT和Lhx8的基因表达，但其不能减少海马和皮层中Aβ斑块沉积。但NSC联合NGF纳米粒移植保护基底前脑胆碱能神经元的具体机制、移植NSC分化的进一步调控及其参与宿主细胞的功能整合等尚需进一步研究。