基于网络药理学和分子对接探讨白花蛇舌草治疗骨肉瘤的作用机制

刘 沁，段辛威，李西海

1香港大学深圳医院，广东 深圳518053；

2福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；

3福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种多发于儿童和青少年的侵袭性原发性骨恶性肿瘤，其确切病理、生理机制尚不明确。当前临床主要采用新辅助化疗加手术的方式进行治疗，患者生存率仍不理想，且尚无有效的系统疗法来应对复发或转移性骨肉瘤［1］。寻找新的骨肉瘤干预药物是当前亟待解决的临床和科研问题。中医药缓解恶性肿瘤临床症状和放化疗增效减毒等方面效果明显［2］，白花蛇舌草具有清热利湿和解毒消痈的功效，其各部位及其黄酮类、三萜类、香豆素类和多糖类提取物或制剂可在增殖、侵袭、耐药等方面对骨肉瘤发挥不同的作用［3-5］，但具体作用机制尚不完全明确。因此，利用网络药理学和分子对接方法研究白花蛇舌草对骨肉瘤干预的分子作用机制，有助于为骨肉瘤临床用药及白花蛇舌草的开发利用提供参考。

1 资料与方法

1.1 白花蛇舌草活性成分筛选和靶点预测

利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology data-base and analysisplatform，TCMSP）筛选出与白花蛇舌草相关的化合物和靶基因，并设置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18作为筛选条件［6］，筛选出有效成分，同时在该数据库中检索出符合要求的成分靶基因，并删除重复靶基因，将筛选出的靶基因作为白花蛇舌草的预测靶基因。

1.2 骨肉瘤相关基因及白花蛇舌草治疗靶点预测

利用GEO-NCBI数据库中GEO Datasets子集，筛选出骨肉瘤相关基因表达测序芯片，选取3个表达显著的芯片GSE28424、GSE19276、GSE16088，利用log 2算法对基因数据整理，筛选出3个芯片中的差异基因，将3个芯片中至少同时存在于2个及以上芯片的差异基因与Genecards数据库、孟德尔OMIM数据库、PharmGKB数据库、Drugbank数据库、TTD数据库检索到的骨肉瘤相关基因取并集作为骨肉瘤疾病基因数据集。

通过Perl语言编辑分析，将白花蛇舌草预测的靶基因与骨肉瘤疾病基因取交集，从而得到白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因，通过这部分交集基因构建起白花蛇舌草-骨肉瘤的分子机制层面联系。

1.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶点调控网络构建

采用Cytoscape 3.8.1软件将白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因与药物成分分别导入，将骨肉瘤靶基因、白花蛇舌草主要有效成分进行可视化编辑，构建白花蛇舌草干预骨肉瘤活性成分-靶点网络。

1.4 蛋白相互作用网络构建及核心靶点筛选

将白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因导入STRING构建蛋白互作网络，并将其保存为tsv文件。采用Cytoscape 3.8.1软件打开文件，在PPI网络的基础上进行拓扑分析，即选取介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部边连通性（local average connectivity-based method centrality，LAC）、网络中心性（network centrality，NC）6种拓扑参数进行分析［7］。以各项拓扑参数值均＞中位数值作为筛选条件，即可得到关键基因。

1.5 生物信息学分析

将白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因用基于R语言的、面向基因组信息分析的Bioconductor软件合集对白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因进行基因本体论（gene onotology，GO）分析、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.6 分子对接分析

选择PPI拓扑分析筛选出的核心网络上的靶基因及其对应的活性成分进行分子对接，在Pubchem数据库查找白花蛇舌草活性成分2D构象，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117软件转换为3D结构并优化最小自由能，使用PDB数据库查找靶蛋白，导入PyMOL 2.4.1软件，去除水分子、分离原有配体，然后导入AutoDockTools 1.5.6软件，使对接位点选择以原有配体为中心，设置网格箱（gird box）为默认值，运用Vina进行分子对接，获得白花蛇舌草中活性分子与靶蛋白的对接结果，将对接结果输出为txt文件和pdbqt文件，打开txt文件查看对接结果，用PyMOL 2.4.1打开查看对接图像。一般认为当结合亲和力（binding affinity）＜-4.25 kcal／mol时说明活性分子与靶蛋白有一定的结合活性，结合亲和力＜－5.0 kcal／mol时有较好的结合活性，结合亲和力＜－7.0 kcal／mol时有强烈的结合活性［7］。

1.7 引用和参考的数据库

见表1。

表1 参考数据库Table 1 Collections of database

2 结 果

2.1 白花蛇舌草中有效活性成分的筛选和靶点预测结果

根据筛选条件OB≥30%、DL≥0.18从TCMSP数据库筛选出7个白花蛇舌草有效成分，见表2。7个有效成分中，2个成分（MOL001646 2，3-甲氧基-6-甲氧基蒽醌、MOL001663 3-表齐墩果酸）靶基因数据缺失，其余5个成分（MOL001659多孔甾醇、MOL001670 2-甲氧基-3-甲基-9，10蒽醌、MOL 000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇、MOL000098槲皮素）共有靶基因169个，见表3。

表2 白花蛇舌草主要有效成分Table 2 Main effective components of Hedyotis diffusa

表3 白花蛇舌草靶基因Table 3 Target genes of Hedyotis diffusa

2.2 骨肉瘤相关基因及共同靶点

骨肉瘤相关基因筛选如下：GEO-NCBI数据库1 376个、Genecards数据库1 904个、孟德尔OMIM数 据 库4个、PharmGKB数 据 库94个、Drugbank数据库2个、TTD数据库7个，删除重复值后得到3 178个骨肉瘤相关基因，见图1。将169个白花蛇舌草靶基因和3 178个骨肉瘤相关基因取交集，得到98个白花蛇舌草-骨肉瘤共同靶基因，这98个靶基因即为白花蛇舌草治疗骨肉瘤的潜在靶点。

2.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶点网络

通过Cytoscape 3.8.1软件将得到的5个有效成分和98个白花蛇舌草-骨肉瘤靶基因构建可视化调控网络，其中MOL001670可调控5个靶基因、MOL000449可调控10个靶基因、MOL000098可调控91个靶基因、MOL000358可调控13个靶基因、MOL001659可调控2个靶基因，有16个靶基因至少被2种及以上有效成分调控，见图2。

2.4 共同靶点蛋白相互作用网络及核心靶点筛选

将98个交集基因导入STRING数据库，设置物种为Homo sapiens，并设置medium confidence为0.900，去除游离节点，得到“白花蛇舌草-骨肉瘤”的PPI网络，该网 络由84个 节 点（Node）、316条 边（Edge）构成，见图3。PPI核心网络由8个节点和51条边组成，见图4。筛选出核心基因8个，分别是雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、JUN、RAC-α丝氨酸／苏氨酸-蛋白激酶（RAC-alpha serine／threonine-protein kinase，AKT1）、G1／S特 异 性细胞周期蛋白-D1（G1／S-specific cyclin-D1，CCND1）、FOS、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、细胞肿瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、MYC。见表4。

图4 筛选PPI网络中的核心基因Figure 4 Screening core genes in the PPI network

2.5 生物信息学分析

将98个交集基因进行GO富集分析和KEGG富集分析。

2.5.1 GO功能富集分析GO富集分析得到P＜0.05的GO条目共计2 205条，具体包括以下：①生物进程（biological process，BP）结果2 037条，包括细胞凋亡负调控、对脂多糖的反应、细胞凋亡信号通路的调控等；②细胞组分CC（cellular components，CC）结果39条，包括膜筏、膜微域、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、转录调节因子复合体、核染色质、细胞周期素-依赖性蛋白激酶全酶复合物等；③分子功能（molecular function，MF）结果129条，包括泛素样蛋白连接酶结合、DNA-结合转录因子的结合、泛素蛋白连接酶结合、DNA-结合转录激活子活性、核受体活性、DNA-结合转录激活子活性和RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合等，各类前10的结果见图5。

图5 GO富集分析结果图Figure 5 Results of GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析得到P＜0.05的通路155条，主要富集在包括前列腺癌通路、膀胱癌通路、胰腺癌、小细胞肺癌、IL-17信号通路、细胞凋亡、肿瘤坏死因子信号通路、p53信号通路、细胞衰老等通路上，前30条通路结果见图6。

图6 KEGG富集结果图Figure 6 Results of KEGG enrichment

2.6 分子对接及结合自由能分析

本 研 究 选 取 核心 靶 点（ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC）和白花蛇舌草的3个有效成分进行分子对接，以验证白花蛇舌草活性成分与靶点的对应关系，通过结合自由能判断分子间的结合能力。结果显示，9组对接结果中结合能均＜－7 kcal／mol，见表5、图7。

图7 分子对接三维图Figure 7 Three dimensional view of molecular docking

3 讨 论

骨肉瘤在中医学里属“石痈”“石疽”“石岩”等范畴，其病因病机是本虚标实，正气亏虚为本，痰浊瘀湿为标［8］。先天肾气亏虚，骨失所养使邪毒趁虚内侵于骨、痰瘀内生致邪毒闭郁在骨、外感邪毒内伤于骨都可导致骨肉瘤发病［9］。白花蛇舌草有清热利湿、解毒消痈、祛湿散结的功效，在国家名老中医抗肿瘤用药规律研究中，白花蛇舌草的使用频次居前5名［10］，如由白花蛇舌草、炙黄芪等组成的清解扶正颗粒在对大肠癌的临床治疗上疗效确切［11］。有研究表明，白花蛇舌草对骨肉瘤增殖、侵袭、耐药都有一定干预作用［4，12］，但具体作用机制有待进一步探明。

本研究通过对筛选出的98个白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因进行分析，PPI分析得到ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC 8个度值最高的核心靶点，可能是白花蛇舌草干预骨肉瘤潜在靶点。GO富集结果显示，交集基因BP主要富集在对细胞凋亡信号通路的调控、对类固醇和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）反应以及氧化应激反应等生物进程上，其中对细胞凋亡信号通路的调控这一生物进程富集了包括TP53和AKT1在内的25个基因，LPS就可通过cAMP／PKA通路上调髓样树突状细胞中IL23表达，从而促进骨肉瘤进展［1］。CC主要富集在膜性结构、转录调节复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物和线粒体等细胞组分上，其中转录调节复合物这一细胞组分上富集了包括JUN、CCND1、FOS、TP53在内的15个基因，JUN与FOS可形成核内转录因子二聚体AP-1介导转录，此外，这也可能与线粒体凋亡途径和膜电位极化有关；MF主要富集在转录因子活性上，这与CC富集结果相一致。KEGG富集结果显示，基因主要富集在膀胱癌和小细胞肺癌等癌症、p53、铂基耐药、细胞凋亡等通路上，度值排名前3的通路是膀胱癌、前列腺癌和糖尿病并发症AGE-RAGE。其中p53信号途径的上调对骨肉瘤的阿霉素化疗具有促凋亡和提高药物敏感性作用［13］，曲古菌素A通过p53信号通路的激活以剂量依赖的方式促进人骨肉瘤细胞（MG63）细胞凋亡［14］。

本研究对2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌、β-谷甾醇、槲皮素3个化合物的分析发现，其可能是白花蛇舌草干预骨肉瘤的主要成分。其中甾醇类（β-谷甾醇）和蒽醌类（2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌）对骨肉瘤作用机制未见报道，但2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌的靶点ESR1与β-谷甾醇的靶点JUN都和骨肉瘤密切相关。槲皮素作为白花蛇舌草中的黄酮类主要成分，对骨肉瘤的干预具有多渠道、多靶标的作用特点。一方面，通过改变骨肉瘤细胞周期，将细胞周期阻抑在S期以抑制增殖和诱导凋亡。另一方面，通过下调甲状旁腺激素受体1（PTHR1）和Bcl-2、上调miRNA-217和BAX提高骨肉瘤放化疗敏感性；还可上调ROS-NUPR1通路增加自噬通量、促进线粒体去极化、改变活性氧浓度来抑制骨肉瘤增殖［15-17］。分子对接结果验证了白花蛇舌草核心分子与靶标蛋白具有很好的结合作用。

骨肉瘤的发生是一个包含增殖、浸润、转植的多阶段多反应过程，8个核心基因都参与了这一过程。其中MAPK、JUN、FOS、CCND1、TP53这5个蛋白可形成信号传导级联，内外源信号传递至MAPK后，MAPK作为一条入核通路上的关键蛋白可将信号传递给核内JUN和FOS，如MAPK家族JNK可磷酸化c-JUN［18－19］。①JUN家族蛋白可在家族内或与FOS家族蛋白形成二聚体，如c-JUN和c-FOS形成核内转录因子二聚体AP-1［20］，AP-1与具有结合位点的基因启动子或增强子结合调节相关基因表达。②JUN和FOS也参与细胞周期调控，两蛋白家族中不同蛋白对细胞周期具有不同的调节作用，如c-JUN可激活CCND1对细胞周期起到正向调节作用，而JUN B则抑制CCND1激酶活性从而延迟G1期。③JUN可调节抑癌基因TP53编码的蛋白p53［21］及其效应因子p21从而扰乱细胞周期［22-24］，而p53异常表达（如突变等）常与上皮细胞恶性转化及骨肉瘤和其他肿瘤恶性预后相关［25］。因此，从这5个靶蛋白入手干预骨肉瘤都取得了良好干预效果。如micRNA-15a、micRNA-16-1和micRNA-466可靶向下调CCND1阻抑骨肉瘤细胞周期［26］，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖；而lncRNA FLVCRAS1则通过靶向下调miRNA381-3p来增加CCND1表达，从而促进骨肉瘤增殖［27］；三氧化二砷（As2O3）联合阿霉素（ADM）可通过MAPK通路抑制微管不稳定蛋白介导的骨肉瘤侵袭［28］。此外，MYC、ESR1、AKT1、MAPK1在骨肉瘤组织或细胞中的表达高于正常水平，通过micRNA、上下游效应因子或抑制剂下调4个基因表达的效应水平可降低骨肉瘤侵袭性，阻抑骨肉瘤进展［29－34］。ESR则在骨肉瘤及阿霉素耐药细胞株中都过表达，ESRα的高表达能增加骨肉瘤细胞对阿霉素的耐药性［35］。

4 小 结

本研究从网络药理学和分子对接的角度证实了白花蛇舌草能通过多成分、多靶点、多途径对骨肉瘤进行干预，作用机制主要体现在干预骨肉瘤增殖、侵袭和耐药等方面，为白花蛇舌草在骨肉瘤的临床使用提供依据。下一步研究可以通过液-质联用色谱等方法鉴别白花蛇舌草的活性成分，并通过实验验证网络药理学筛选出来的关键靶点和反应级联，从而为白花蛇舌草在骨肉瘤中的应用提供进一步依据。