一种杂色曲霉素胶体金免疫快速检测试纸条的研制

贾芳芳 张 阔 葛彩霞 魏力杰 索金玉 王兆芹

（1. 北京望尔生物技术有限公司， 北京 102206； 2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心， 北京102206； 3.北京市延庆区动物疫病预防控制中心， 北京 102100； 4. 滦州市农业农村局， 河北滦州 063799）

杂色曲霉素 （sterigmatocystin） 是一种真菌毒素， 可由10 余种真菌代谢产生， 能够诱发实验动物产生多种癌瘤[1～2]。 研究表明， 杂色曲霉素与人的胃癌有关， 还可转化成更强烈的致癌物黄曲霉毒素。 杂色曲霉素可污染小麦、 玉米等谷物[3～5]。

由于杂色曲霉素对人畜的危害大， 分布广， 因此需要一种有效而快速的手段检测谷物中杂色曲霉素。 目前有传统的仪器检测方法， 如液相色谱－串联质谱法[6]、 分散固相萃取－超高效液相色谱－三重四极杆质谱法[7～8]、 超高效液相色谱－串联质谱法[9]、 高效液相色谱法[10～13]， 上述仪器方法成本高，用时较长， 而免疫化学检测法具有低成本、 用时较短、 特异性较强等优点[14～15]。 本文研究制备一种杂色曲霉素单克隆抗体， 将其用于胶体金免疫层析试纸条研制， 以期使检测时限及费用满足基层实验室的检测需求。

一、 材料与方法

（一） 材料与仪器杂色曲霉素等标准品 （纯度≥95%） 购自北京标准物质研究中心。 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 牛血清白蛋白 （BSA）、 卵清蛋白 （OVA） 均购自美国 Sigma 公司。 胶体金分析仪由北京勤邦生物技术有限公司提供。 涡旋仪购自湖南湘立科学仪器有限公司[14～15]。

（二） 方法

1. 杂色曲霉素半抗原的制备。 取16 mg 杂色曲霉素， 加入甲醇20 mL 溶解， 加入3－马来酰亚胺丙酸肼 18 mg， 充分搅拌。 加入醋酸钠 1.7 g， 搅拌溶解， 加热， 回流反应 12 h， 停止反应， 旋蒸，除去甲醇。 加水 50 mL、 氯仿 60 mL， 充分振荡，静置， 分去水相。 加水 70 mL， 振荡， 静置， 分去水相， 有机相用无水硫酸钠干燥蒸干， 加乙醚3 mL， 充分洗涤， 除去上清液， 固体沉淀， 真空干燥， 得到马来酰亚胺丙酸化杂色曲霉素半抗原产物13 mg （见图 1）， 回收率 53%。

图1 杂色曲霉素半抗原合成

2. 免疫原的制备——杂色曲霉素半抗原与牛血清白蛋白 （BSA） 偶联物合成。 取牛血清白蛋白（BSA） 25 mg， 加入 0.1 mol/L PB （pH 8.0） 溶解，加二硫苏糖醇1.9 mg， 室温下反应12 h， 得到A液； 取马来酰亚胺丙酸化杂色曲霉素半抗原9 mg，加 DMF 1 mL 溶解， 得到 B 液， 缓慢滴加到 A 液中， 室温继续反应 9 h， 停止反应。 以0.02 mol/L PBS 透析纯化 3 d， 每天换液 3 次， 得到 BSA－杂色曲霉素偶联物， 即为免疫原， 分装， －20℃保存， 备用。

3.包被原的制备——杂色曲霉素半抗原与卵清蛋白（OVA） 偶联物合成。 取卵清白蛋白 （OVA）20 mg， 加入 0.1 mol/L PB （pH 8.0） 溶解， 加二硫苏糖醇 0.94 mg， 室温反应 12 h， 得到 A 液； 取马来酰亚胺丙酸化杂色曲霉素半抗原4 mg， 加DMF 1 mL 溶解， 得到 B 液， 缓慢滴加到 A 液中， 室温继续反应 9 h， 停止反应。 以 0.02 mol/L PBS 透析纯化3 d， 每天换液3 次， 得到OVA－杂色曲霉素偶联物， 即为包被原， 分装， －20℃保存， 备用。

4.将杂色曲霉素单克隆抗体－胶体金标记物冻干到微孔试剂上。 将100 μL 杂色曲霉素单克隆抗体－胶体金标记物加入微孔试剂微孔板中， 置于冷冻干燥机， 冷阱温度为－50℃， 预冻 3 h， 再真空干燥15 h， 即得到杂色曲霉素单克隆抗体－胶体金标记物冻干的微孔试剂[14～15]。

5. 检测方法。 向微孔中加入 100 μL 待检样本溶液， 混匀， 室温下孵育 3 min， 吸取 70 μL 滴至试纸条上， 反应 10 min， 根据示意图 （见图 2） 判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。 其他时间判读无效。 检测时间共计15 min， 即为加样混匀时间 （约 2 min）、 孵育时间 （3 min） 与反应时间（10 min） 的总和。

图2 杂色曲霉素胶体金试纸条结果判定示意图

6. 样品检测限的确定。 在空白饲料样品 （小麦、 玉米） 中分别添加杂色曲霉素标准品至质量浓度为 0、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5 μg/L， 按照上文检测方法用3 批试纸条进行检测， 每个浓度重复5 次，根据实验结果确定样本检测限[14～15]。

7. 试纸条的特异性。 分别配制 500 μg/kg 的黄曲霉毒素B1、 黄曲霉毒素M1、 赭曲霉素等药物，用试纸条重复检测3 次， 判断试纸条的特异性。

8. 检测的准确性。 按照农业农村部文件要求，以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。 取经仪器确证的50 份阴性饲料样品 （质量浓度＜1 μg/kg）、 50 份阳性饲料样品 （质量浓度＞1 μg/kg）， 用该试纸条检测杂色曲霉素药物残留， 计算假阳性率和假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》 规定， 试纸条假阳性率应＜5%， 假阴性率应为零[14～15]。

9. 试纸条的稳定性。 将试纸条保存于2～8℃环境中， 每隔1 个月检测试纸条的准确性， 连续测定 15 个月[14～15]。 具体方法为： 分别检测经仪器确证的 20 份阴性饲料样品 （质量浓度＜1 μg/kg）、 20份阳性饲料样品 （质量浓度＞1 μg/kg）， 重复测定2次， 根据实验结果判定试纸条的稳定性[14～15]。

二、 结果与分析

（一） 样品检测限配制杂色曲霉素浓度分别为 0、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5 μg/L 的小麦和玉米饲料样品， 按照上文 “检测方法” 步骤进行检测， 确定检测限[14～15]。 结果显示， 该试纸条的检测限为 1 μg/kg （见表 1）。

表1 杂色曲霉素快速检测试纸条的检测限

（二） 特异性以该试纸条检测 500 μg/kg 的黄曲霉毒素B1、 黄曲霉毒素M1、 赭曲霉素等药物，结果均呈阴性， 表明该试纸条特异性较好。

（三） 准确性用该试纸条分别检测50 份阴性小麦饲料样品和50 份阴性玉米饲料样品， 检测结果如表 2 所示， 均为阴性， 说明假阳性率＜5%； 用该试纸条分别检测50 份阳性小麦饲料样品和50 份阳性玉米饲料样品， 检测结果如表2 所示， 均为阳性， 说明试纸条假阴性率为零， 符合 《农残办技术材料要求及审查程序》 要求[14～15]。

表2 准确性测定

（四） 稳定性对试纸条进行稳定性测试， 测定结果见表 3， 可以看出， 在 12 个月内， 试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求， 从第13 个月起， 试纸条会出现少量失效、 假阳性等现象[14～15]。

表3 稳定性测定

三、 结论

本文制备出的杂色曲霉素半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原， 最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。 按照 《农残办技术材料要求及审查程序》 要求， 对试纸条进行了特异性、 准确性、 稳定性等性能测试， 均符合要求。 试纸条的检测时间仅为15 min， 比现有文献中仪器方法用时更短， 操作更简便。 试纸条检测限为1 μg/kg， 灵敏度较高。