腐植酸对干旱胁迫下燕麦叶片碳同化酶活性及产量的影响

朱珊珊,米俊珍,赵宝平,孙梦媛,李英浩,刘景辉

(内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019)

燕麦是我国特色粮饲兼用型作物，具有营养成分高，抗逆性强等优点，在我国西北、华北、西南等干旱半干旱少雨地区种植面积较大，干旱是限制其生长发育和高产的重要因素[1]。干旱胁迫会抑制作物旗叶光合作用的酶活性[2]，影响光合碳同化，导致作物减产[3]。严重干旱会导致植物叶片碳同化酶活力降低[4-5]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)可通过植物内部释放的二氧化碳和氮来提供碳骨架以进行生物合成，缓解干旱胁迫[6-7]。光合产物的积累量和作物产量与其叶片中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)和乙醇酸氧化酶(GO)活性有关[4,8]。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、GO、PEPC及GAPD是植物碳同化的关键酶，提高其效率和活力是促进植物光合作用的重要途径[4,8-10]。腐植酸是存在于土壤、河泥和煤炭之中的天然有机混合物[11]，有促进作物生长、节肥增效、增强作物抗逆性等功效，是一种多功能叶面肥[12]。张志芬[13]研究发现，喷施腐植酸可抑制燕麦叶片的气孔开度，增加气孔阻力，降低蒸腾作用，缓解燕麦干旱胁迫。腐植酸能够缓解干旱对麻黄叶片中叶绿体片层结构的破坏，增加叶片的叶绿素含量和净光合速率，显著减轻由干旱胁迫造成的氧化损伤，提高麻黄的耐旱性，从而提高其产量[14]。梁太波[15]研究发现，腐植酸肥料可以提高旱作小麦旗叶实际光化学效率和光合电子传递速率，延缓衰老，提高水分利用效率。以上研究表明，干旱胁迫下，腐植酸类物质能通过改变作物叶绿素荧光参数和光合参数、降低电子传输通量、提高植物体内气体交换率，显著提高作物光合作用、抗旱能力以及产量[16-18]。但有关干旱胁迫下腐植酸对燕麦叶片的碳同化酶活性及产量影响的研究鲜有报道。本研究以燕科2号为材料，分析不同程度干旱胁迫下喷施腐植酸对燕麦不同生育时期叶片碳同化酶活性和产量的影响，以期为燕麦抗旱、增产措施的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设计

试验材料为燕科2号，由内蒙古农牧业科学院提供。腐植酸水溶肥料采购于内蒙古永业农丰生物技术有限责任公司，其水溶腐植酸含量≥50 g·L-1，N+P+K≥200 g·L-1，微量元素(锰、硼、钼、锌等)≥10 g·L-1。于2019年4月至8月在内蒙古农业大学燕麦产业研究中心温室进行盆栽试验。试验选用直径为23 cm、高18 cm的塑料盆进行，内装混合土5 kg(河沙∶泥炭土体积比1∶1)，泥炭土中N+P+K> 10 g·kg-1，有机质含量> 50 g·kg-1，pH值为5.5～8.5，土壤含水率为9%。播种前每盆施入2 g磷酸二铵(N 18%，P2O546%)做底肥。设置3个水分处理：正常供水(田间最大持水量的75%，M1)、中度干旱胁迫(田间最大持水量的45%，M2)和重度干旱胁迫(田间最大持水量的30%，M3)；2个喷施处理：喷施500倍稀释的腐植酸水溶肥料(HA)和等量清水(CK)，共6个处理。采用随机区组排列，每个处理重复3次，每重复种植10盆，每盆播种30株，三叶期定苗为20株。2019年4月14日播种，8月21日收获。从拔节期(5月18日)开始控水至成熟期，控水方法采用称重差值法[19]。分别在拔节期、抽穗期、灌浆期的上午 9：00-11:00进行HA和CK处理，在植株叶片均匀喷施至叶面湿透无滴水，每盆喷施量约14 mL；喷施7 d后取燕麦中上部叶片，投入液氮速冻后，放入-80℃冰箱冷藏，用于碳同化酶活性的测定。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 碳同化酶测定

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和乙醇酸氧化酶(GO)活性均采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒测定，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)活性采用上海继锦化学科技有限公司试剂盒测定。

1.2.2 地上部干物质积累量和产量及其构成因素测定

地上部干物质积累量：分别于拔节、抽穗、灌浆期叶面喷施处理后7 d取样，每个重复取10株，放入纸袋，烘箱105℃杀青30 min，80℃烘干到恒重。

产量及构成因素：燕麦成熟时收获、考种，每个处理取5株， 测定主穗长、单株小穗数、穗粒数、穗粒重和千粒重，并测每盆的籽粒产量，重复3次。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2010进行数据处理，用SPSS 22.0进行显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 腐植酸对不同水分处理燕麦叶片Rubisco活性的影响

由图1可见，从拔节期到灌浆期，不同水分处理燕麦叶片的Rubisco活性均呈先升高后降低趋势。干旱胁迫导致叶片Rubisco活性显著降低。M1水分条件下，HA处理拔节期、抽穗期和灌浆期燕麦叶片Rubisco活性较CK分别增加 5.62%、2.79%、6.88%，仅在灌浆期差异达到显著水平。M2水分条件下，HA处理各时期叶片Rubisco活性较CK均显著提高，拔节期、抽穗期和灌浆期分别增加了22.38%、25.83%、 19.17%。水分条件为M3下，拔节期、抽穗期和灌浆期HA较CK处理叶片Rubisco活性分别增加了28.45%、34.41%、32.22%，差异均达到显著水平。以上结果说明，干旱胁迫显著降低了燕麦叶片Rubisco活性；喷施腐植酸可有效缓解干旱胁迫对燕麦叶片Rubisco活性的影响，尤其在M3水分条件下效果更佳。

2.2 腐植酸对不同水分处理下燕麦叶片GAPD活性的影响

随着干旱程度的加深，各时期叶片中的GAPD活性均呈降低趋势(图2)。与CK相比，M1水分条件下喷施腐植酸可以提高GAPD活性，但只在抽穗期效果显著；在M2和M3水分条件下，喷施腐植酸均能使各时期GAPD活性显著增加，其中在M3水条件下增加的幅度最大，拔节期、抽穗期和灌浆期分别增加36.55%、31.80%、39.60%。这说明喷施腐植酸可不同程度地减小干旱胁迫对燕麦叶片GAPD活性的影响，在M3处理下效果较好。

2.3 腐植酸对不同水分处理下燕麦叶片PEPC活性的影响

由图3可知，燕麦叶片的PEPC活性在抽穗期达到最高。在M1水分条件下，喷施腐植酸后燕麦叶片PEPC活性与CK相比仅在拔节期差异显著；当水分条件为M2和M3时，喷施腐植酸后叶片中的PEPC活性较CK在各时期均显著增加，其中在M2水分条件下，拔节期、抽穗期和灌浆期喷施腐植酸较CK分别增加了21.43%、 24.04%、25.42%，M3水分条件下，拔节期、抽穗期和灌浆期喷施腐植酸较CK分别增加了 38.24%、32.96%、33.81%。这说明喷施腐植酸提高了干旱胁迫下燕麦叶片的PEPC活性，且M3水分条件下提升幅度最大。

2.4 腐植酸对不同水分处理下燕麦叶片GO活性的影响

从拔节期到灌浆期，燕麦叶片GO活性先降低后升高(图4)。干旱胁迫导致燕麦叶片GO活性升高，且随着干旱程度的加剧而增加。在M1水分条件下，喷施腐植酸后燕麦叶片GO活性与CK相比差异均未达到显著水平；当水分条件为M2和M3时，喷施腐植酸后叶片GO活性在各时期与CK相比均显著降低，其中M2条件下，拔节期、抽穗期和灌浆期较CK分别降低16.18%、13.64%、14.65%，M3条件下，拔节期、抽穗期和灌浆期分别降低16.85%、16.75%、18.39%。这表明干旱胁迫显著提高了燕麦叶片 GO的活性，喷施腐植酸能有效缓解这种增长趋势。

表1 不同处理下燕麦地上部干物质积累量的影响Table 1 Effect of different treatments on above-ground dry matter mass of oat g·10-1 plants

2.5 腐植酸对不同水分处理下燕麦地上部干物质积累量的影响

由表1可知，随着干旱程度的加深，燕麦地上部干物质积累量显著减少。与CK相比，在M1水分条件下，HA处理对燕麦各时期地上部干物质积累量没有显著影响；在M2和M3水分条件下，拔节期、抽穗期、灌浆期HA处理燕麦地上部干物质积累量均较CK显著增加，增幅分别为10.64%、 3.82%、2.09%和16.56%、4.20%、 2.43%。

2.6 腐植酸对不同水分处理下燕麦产量及其构成因素的影响

表2显示，干旱胁迫导致燕麦产量及其构成因素均显著下降，且均表现为M1>M2>M3。与CK相比，喷施腐植酸能使燕麦产量增加，M1、M2、M3水分条件下分别增加2.63%、8.46%和10.26%，其中在M2和M3水分条件下差异达到显著水平。从产量构成因素来看，喷施腐植酸后，穗长、穗粒重和千粒重较CK均增加，增加幅度均表现为M3>M2>M1，其中穗粒重和千粒重在M2和M3水分条件下增加显著，分别增加 15.38%、16.07%和10.74%、15.67%；与CK相比，喷施腐植酸可以提高燕麦单株小穗数、穗粒数、穗数，但差异均不显著。说明喷施腐植酸主要通过降低干旱对千粒重的影响而增加产量。

2.7 碳同化酶活性与产量及其构成因素的相关性分析

Rubisco活性与穗粒重和产量的相关性均达到极显著水平，与千粒重呈显著正相关，与穗粒重的相关性最大。PEPC和GAPD活性与穗粒重、千粒重和产量均呈极显著正相关，与穗粒重的相关性最大。GO活性与穗粒重、千粒重和产量均极显著负相关，与产量的相关性最大。穗粒重与千粒重与产量呈极显著正相关(表3)。

表2 不同处理对燕麦产量及其构成因素的影响Table 2 Effect of different treatments on oat yield and its components

表3 燕麦叶片碳同化酶活性与产量及其构成因素的相关性分析Table 3 Correlation analysis of carbon assimilating enzyme activity in oat leaves with yield and its components

3 讨 论

植物的光合作用是干物质积累和产量形成的基础，较高的光合碳同化能力是获得高产的前提。卡尔文循环中，Rubisco 是影响光合碳同化的关键酶，能使逆境胁迫中的植物维持光合作用[20]。干旱胁迫会导致 Rubisco 活性降低，光合作用产生限制[16,21-22]，本研究结果与此相似，随着干旱胁迫程度的增加，Rubisco活性逐渐下降，可能干旱胁迫使相应酶量降低，进而导致 Rubiso 活性下降，影响了光合碳同化[23]。在重度干旱胁迫中，作物叶片光合能力的降低主要受非气孔因素限制，叶片光合放氧能力降低，光合磷酸化解偶联，阻碍CO2扩散，RuBP羧化酶活性下降，光合器官的生理功能遭到破坏，影响作物光合作用[24-25]，喷施腐植酸使植物在干旱胁迫下维持光合系统的稳定和相对较高的光合作用，对非气孔因素引起的光合限制具有缓解作用[26-27]。有研究表明，在氮胁迫下添加腐植酸比未添加处理RuBPCase活性显著提高[28]。Jannin等[29]提出，腐殖质处理后的植物Rubisco活性增加可能是由于细胞内叶绿体数量增加所致。本研究表明，重度干旱胁迫下，喷施腐植酸后燕麦叶片中Rubisco酶活性与CK相比提高幅度最大，中度胁迫条件下其活性虽有提高，但幅度较小。这可能是由于腐植酸在重度干旱胁迫下更能缓解干旱对叶绿体的伤害[13]，增加RuBP羧化酶固定CO2的量，进而提高Rubisco的羧化效率，提高作物的光合能力。

GAPD是糖异生和糖酵解过程中的关键酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PGA)还原成3-磷酸甘油醛，影响光合环的运转效率及光合产物的积累[30]。Ziaf等[31]发现，干旱胁迫下GAPD基因的表达减轻了植物膜脂过氧化的程度。有研究表明，随着水分胁迫时间的延长和胁迫强度的加剧，小麦旗叶的GAPD活性逐渐降低[23]，与本研究结果一致。在逆境条件下，生物体中GAPD基因的转录及表达水平不稳定，大多数生物体都增加表达GAPD[32]。郭子平[33]研究表明，干旱胁迫下，小麦叶片总GAPD活性随着时间的延长而增加。在本研究中，随着干旱胁迫程度的加剧，叶片中的GAPD活性逐渐降低，与上述研究结果不同，可能是因为不同抗旱类型作物受到干旱胁迫时GAPD基因的表达调控因子和信号传递途径存在差异，也可能是不同作物、不同品种的GAPD蛋白在植物细胞的失水耐受过程中作用不同[34]。有研究表明，腐植酸可以诱发含有NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPN)蛋白产生[35]。在本研究中，两种干旱胁迫条件下喷施腐植酸，燕麦叶片的GAPD活性均能提高，但在重度胁迫下变化幅度较大。可能是因为腐植酸在植物细胞过度失水时诱导了GAPDH蛋白的大量表达，导致酶活性提高，促进光合产物的积累，最终增加燕麦的穗粒重，使产量增加。

PEPC在CAM和C4植物中的主要生理作用是初级CO2的固定还原[36]。有研究表明，C3植物中也存在PEPC[37]，在大部分C3植物体内中，PEPC具有回补作用，补充三羧酸循环，其中间产物能被用于多种生物合成及氮同化消耗[36]。关于干旱胁迫对PEPC活性的影响，各试验结果有所不同。有研究表明，在水分亏缺下，小麦PEPC活性明显增强[18]；而张 旭等[38]认为，干旱导致小麦旗叶PEPC活性下降。玉米叶片中PEPC活性在水分胁迫下先升后降[39]。在本研究中，随着干旱胁迫程度的加剧，PEPC活性均逐渐降低，有可能是不同种类的植物应答干旱的生态适应性机制不同[40]。喷施腐植酸后，PEPC活性均有所提高，且土壤水分含量低时提升效果更佳，可能是在过度失水下，腐植酸在一定程度上更能诱导PEPC酶蛋白的表达，具体原因还需进一步探讨。

GO在植物光呼吸代谢中具有关键作用，能提高植物光合效率[41]。随着干旱胁迫的加剧，柠条中GO活性逐渐增强[42]，与本研究研究结果相似。这说明随着干旱程度加剧，乙醇酸氧化酶活性也随之升高。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸的氧化过程中伴随着 H2O2的生成，是H2O2总数的70%[43]。水分胁迫能够增加GO活性，诱导大量H2O2的累积[44]。Garcar等[45]研究发现，腐植酸可通过降低水稻H2O2的含量，提高膜的通透性，对干旱引起的氧化应激反应起到保护作用。本研究结果表明，腐植酸能使干旱条件下燕麦叶片GO活性降低，其中在重度干旱胁迫时，喷施腐植酸较CK处理相比降低幅度更大。这说明腐植酸可能是通过减少过氧化氢的生成来抑制乙醇酸氧化酶的活性，降低燕麦的光呼吸，增加作物的光合作用。

综上，干旱胁迫通过改变碳同化酶活性，降低光合碳同化能力，从而影响燕麦的干物质积累和产量形成，喷施腐植酸能显著提高燕麦叶片Rubisco、GAPD和PEPC活性，提高碳的同化能力，降低GO活性，促进光合作用，增加产量，当田间最大持水量为30%提升幅度更大。