电解多维对大黄鱼仔稚鱼尾部骨骼发育的致畸性初探

陈 佳，柯巧珍，余训凯，张文兵，黄匡南，翁华松，包欣源，刘兴彪，刘家富*

（1.大黄鱼育种国家重点实验室，宁德市富发水产有限公司，福建宁德 352103；2.中国海洋大学水产学院，山东青岛 266071）

大黄鱼（Larimichthys crocea）是目前我国养殖规模最大的海水鱼类，2019年养殖产量达22.55×104t，年育苗量达34.16亿尾［1］。在以往大黄鱼育苗过程中，由于仔稚鱼期大黄鱼苗尚未或少量摄食人工颗粒饲料，育苗户时常往育苗池泼洒鱼用电解多维（鱼用多种维生素预混合料），以保障仔稚鱼对各种维生素的正常需求。鱼用电解多维富含大黄鱼苗生长发育所必需的多种维生素，但育苗场施用电解多维后，大黄鱼仔稚鱼发育畸形现象时有发生，且目前未见相关研究报道。2014年至今，宁德市多家育苗场培育的大黄鱼仔稚鱼出现尾部发育畸形，对生产造成重大损失。因此，本研究初步探讨电解多维对大黄鱼仔稚鱼尾部骨骼发育致畸性原理，通过实验结果为指导生产中电解多维的最佳使用策略提供基础资料，进而指导大黄鱼苗种安全生产。

1 材料与方法

1.1 实验条件与材料

实验用鱼卵：闽-粤东族大黄鱼受精卵。

养殖设施：100 m3育苗池（长×宽×深＝10 m×5 m×2 m）。

实验用水：过滤海水充分曝气，盐度23～24，水温维持在（25±0.5）℃，pH为7.8～8.2，溶氧量≥5 mg·L－1。

实验药剂：电解多维（粉剂）；产品名称：鱼用维生素预混合饲料（JG352）；生产厂家：湖北省金谷药业有限公司；产品批准文号：鄂饲（预）字（2014）178131；每千克成分含量：维生素A≥1 200 000 IU，维生素D3≥300 000 IU，维生素E≥4 000 mg，维生素B1≥3 500 mg，维生素B2≥4 000 mg，维生素B6≥3 000 mg，维生素B12≥5 mg，维生素C≥4 000 mg，烟酸≥8 000 mg，叶酸≥500 mg，水分≤10%。

1.2 实验方法

设置实验组1、实验组2、实验组3和对照组，每组2个重复，每个重复在单口100 m3育苗池中放入3 kg大黄鱼受精卵，进行正常的受精卵孵化和苗种培育操作。通过预实验，各组选择以孵化后3 d（初孵仔鱼开口期）或20 d（稚鱼初始期）为电解多维浸泡或投喂起始时间。实验组1泼洒电解多维的起止时间为受精卵孵化后的第3～10 d，电解多维浓度5.0 mg·L－1；实验组2泼洒电解多维的起止时间为受精卵孵化后的第20～27 d，电解多维浓度5.0 mg·L－1；实验组3拌料投喂电解多维起止时间为受精卵孵化后的第20～27 d，电解多维每天投入量占仔稚鱼体质量的比重为30 mg·kg－1；对照组不泼洒也不拌料投喂电解多维。

实验开始时，每口育苗池中分别加入增温海水，保持曝气，根据大黄鱼消化系统发育情况，3～19 d以轮虫、丰年虫和桡足类饱食投喂鱼苗，20 d后以人工微颗粒饲料饱食投喂鱼苗。每24 h更换等电解多维浓度的实验用水一次，显微镜下观测并记录大黄鱼仔稚鱼尾柄发育情况，及时捞除死亡个体。

1.3 实验数据处理

利用Olympus公司CX31型数码显微镜和尼康图像软件开展图像采集，并分析电解多维对大黄鱼仔鱼期和稚鱼期尾部骨骼发育的影响。

2 实验结果

实验组1、2、3和对照组的仔稚鱼3 d时尾杆骨均呈平直形，尾鳍发育正常（图1－A）。

10 d时实验组1的仔鱼尾柄全部呈现形状因子减小、面积减小，其外形表现为尾部骨骼畸形，尾鳍无法发育，尾部外形趋向于圆形（图1－B）；10 d后停止泼洒电解多维，14 d、21 d和27 d时仍观察到实验组1仔稚鱼的尾柄畸形现象（图1－C，图1－D，图2－A）。表明仔鱼期大黄鱼对电解多维非常敏感，并发生明显的发育畸变效应，且仔鱼畸变后表现为不可逆。

实验组2、3和对照组的仔鱼尾鳍3～27 d均正常发育，21 d和27 d时尾鳍的尾上骨和尾下骨均清晰可见，尾杆发育正常（如图1－D，图2－B，图2－C，图2－D），表明实验组2和3稚鱼期（受精卵孵化20 d后）大黄鱼对电解多维不敏感，即无论以浸泡或拌料投喂方式施用电解多维，与对照组大黄鱼苗相比，实验组2和实验组3的大黄鱼苗未发生任何畸变。

图1 孵化后3～21 d实验组和对照组大黄鱼仔稚鱼尾部骨骼特征示例Fig.1 Characteristics of caudal skeletons of Larimichthys crocea larvae（3-21 dph）in experimental group and control group

图2 孵化27 d后实验组1、2、3和对照组大黄鱼仔稚鱼尾部骨骼分化发育情况示例Fig.2 Examples of differentiation and ontogeny in the caudal skeletons of Larimichthys crocea larvae（27 dph）in experimental group and control group

3 讨论

3.1 电解多维对大黄鱼仔稚鱼的致畸性原理分析

在鱼类发育的仔稚鱼期，遗传、营养、水环境和疾病都是导致骨骼发育畸形的主要影响因子［2］。鱼类的脊索和尾部骨骼是畸形发生率最高的部位［3］。其中尾部骨骼畸形主要表现为尾上骨、尾下骨分化受抑制，尾椎骨畸形等［4］。在人工培育条件下，可通过筛除表型畸形的亲本，从而杜绝遗传因素造成的畸形；因此环境和营养因素是仔稚鱼骨骼发育畸形的主要诱因［5－6］。

电解多维中维生素A、D是人和动物生长发育中所必需的维生素，这两种维生素同为脂溶性维生素［7］，其进入机体后均在小肠部位被吸收，其中一种维生素过量会打破内分泌系统的平衡，进而在转录水平和翻译水平影响到骨骼矿化相关蛋白的表达与活性，影响机体对其他维生素的吸收利用，在生命周期的前两周容易发生将一些成骨细胞转化为脂肪细胞的变化，而成骨细胞的缺失很可能导致了骨骼畸形，最终影响生物的正常骨骼发育［8］。

维生素A是鱼类骨代谢的关键营养因子，其可能影响仔稚鱼阶段骨骼发育［9－10］。维生素A的代谢是通过两组核内受体进行［11］，这些受体能够与维生素D受体或过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）形成多聚体功能单元，并与骨化或骨骼代谢相关基因的DNA结合区域结合，对其进行调控［12］。饵料中添加超剂量的维生素A会打破营养平衡，造成仔鱼椎骨融合等骨骼发育畸形［13－14］。此外，在青鳉（Oryzias latipes）的研究中发现，视黄酸能够通过视黄酸受体介导多环芳香烃受体基因的表达，进而调控青鳉骨骼的发育和形成［15］。本研究发现，在对照组大黄鱼仔鱼期，鱼苗通过摄食轮虫、丰年虫和桡足类，其骨骼即可正常发育，这应该与轮虫、丰年虫和桡足类体内含有丰富的维生素A等营养成分有很大的相关性。同时，20～27 d大黄鱼仔稚鱼在接受电解多维5.0 mg·L－1的水体浓度泼洒或每天按占仔稚鱼体质量比30 mg·kg－1的浓度拌料投喂，均未出现骨骼畸形，这进一步说明电解多维诱发骨骼畸形与大黄鱼个体发育阶段存在关联。

维生素D是维持骨骼中钙和磷平衡、维护骨骼完整的物质［16］。维生素D能够通过维生素D结合蛋白和维生素D受体促进各种钙结合蛋白与转运蛋白的表达，调节钙元素的摄取以保持一定的血钙含量，进而维持骨骼中矿物元素稳态和骨骼矿化［17－18］，能直接参与成骨细胞的分裂、分化以及矿化作用等过程［19］。欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）幼鱼在骨骼形成过程中，对低水平的维生素D含量变化也表现出高度敏感性，幼鱼饮食中摄入过量的维生素D（＞27.6 IU·g－1）会引发2个骨细胞分化、成熟的重要因子——骨形态测定蛋白-4（BMP-4）和类胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的基因表达不同步，主要是IGF-1受抑制表达水平低，从而造成骨钙素表达低，骨骼矿化程度低［17－18］。维生素D的缺乏和过量添加均会造成海水养殖鱼类初孵仔鱼脊柱和鳃骨发育异常［4，20］。本研究中实验组1的3～10 d大黄鱼仔鱼骨骼发育出现畸形，其成因或可从上述维生素D摄入不均衡而造成实验对象骨细胞关键分化因子表达异常的结果得到启示。

维生素C是鱼类重要的微量营养物质之一，它是合成骨胶原的必需成分［21］。维生素C缺乏症会引起骨骼去矿化，引起仔稚鱼骨骼畸形［22］。如在闪光鸭嘴鲶（Pseudoplatystoma coruscans）的研究中发现，饲料中缺乏维生素C时，鱼的头部和颌骨的骨骼变形，同时鱼鳍也呈现脆弱性［23］。此外，有研究表明，在缺乏维生素E的情况下，维生素C可以在一定程度上起到补偿作用，从而降低大口黑鲈（Micropterus salmoides）骨骼畸形发生率［24］，但长期高剂量的维生素C也有碍骨细胞的形成。本研究发现泼洒5.0 mg·L－1的电解多维能够造成3～10 d大黄鱼仔鱼发育致畸性达100%，但对于这种骨骼发育畸形的分子机制和细胞分化转化机制等仍需要进一步深入探究，以为以后营养性预防奠定基础。

3.2 预防电解多维对大黄鱼仔稚鱼致畸的措施

本研究表明，在大黄鱼仔稚鱼培育过程中，维生素使用过量（浓度5.0 mg·L－1）会对仔鱼（1～10 d）骨骼发育造成严重胁迫，致畸性可达100%。正常情况下，大黄鱼仔鱼通过摄食轮虫和丰年虫即可正常发育，无需施用电解多维强化营养，因此，对于仔鱼（1～10 d）不建议施用；20 d后使用电解多维对大黄鱼稚鱼骨骼发育无显著影响。此外，对于特定维生素过量造成大黄鱼仔稚鱼骨骼发育的影响，需要进一步定量研究后，才能用以指导不同苗种培育时期维生素的正确施用剂量，从而保障大黄鱼苗种繁育工作健康发展。