QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱测定枇杷中氯苯嘧啶醇残留量

胡彧娴 林芗华 赖添财

摘 要：建立了QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱测定枇杷中氯苯嘧啶醇残留量方法，样品经乙腈提取，N丙基乙二胺（PSA）净化，高效液相色谱串联质谱测定。结果表明：氯苯嘧啶醇在0.5～200 μg·L-1浓度范围内线性关系良好（ r 2=0.999 4），检出限为0.14 μg·kg-1，定量限为0.5 μg·kg-1;氯苯嘧啶醇在2、20、200 μg·kg-1添加水平下，平均回收率分别为87.0%、97.4%和96.7%，相对标准偏差（RSD）分别为8.3%、7.9% 和4.3%。该方法简单快速，灵敏度高，能够满足残留检测要求。

关键词：氯苯嘧啶醇;枇杷;残留;QuEChERS法;高效液相色谱串联质谱

中图分类号：S 481.8   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）07-0069-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.013

Determination of Fenarimol Residues in Loquat by UsingQuEChERS Combined with HPLCMS/MS

HU Yuxian， LIN Xianghua， LAI Tiancai*

（Zhangzhou Agricultural Inspection and Monitoring Center， Zhangzhou， Fujian 363000， China）

Abstract： A method based on QuEChERS combined with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） was established for the determination of fenarimol residues in loquat. The samples were extracted by acetonitrile， purified by Nprimary secondary amine （PSA）， and determined by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. The results showed that： the linearity of fenarimol was good in the concentration range of 0.5～200 μg·L-1 （ r 2=0.999 4）， the limit of detection was 0.14 μg·kg-1， and the limit of quantitation was 0.5 μg·kg-1. The average recovery rates of fenarimol were respectively 87.0%， 97.4% and 96.7% at the adding level of 2， 20 and 200 μg·kg-1， with the relative standard deviations （RSD） of 8.3%， 7.9% and 4.3%， respectively. The method was simple， rapid and sensitive， which could meet the requirements of residue detection.

Key words： Fenarimol; Loquat; Residue; Method of QuEChERS; HPLCMS/MS

氯苯嘧啶醇又名樂必耕，异嘧菌醇，属低毒、广谱的内吸性杀菌剂，兼有保护和治疗作用，是一种麦角甾醇生物合成抑制剂，能抑制病原菌菌丝生长[1-3]，主要应用于果树、蔬菜及观赏植物等，对白粉病、黑星病、锈病等有一定的防治效果[3-4]。枇杷果肉营养丰富，风味佳良，具有止咳润肺、下气等功效[5]，深受人们的喜爱，在福建、广东、广西、台湾等地广泛种植，而漳州市是福建省枇杷种植的主要产区之一。在栽培过程中为防治枇杷病虫害，农药的使用成为农户果园管理的重要手段。

迄今，国内对氯苯嘧啶醇的研究主要集中在光化学降解与环境转归方面[6-10]，对其残留检测方法的研究较少[11-13]，而在枇杷上的残留检测方法尚未见报道。农产品中农药残留量的检测，其样品前处理方法主要有固相萃取法、液液萃取法、凝胶渗透色谱（GPC）法和QuEChERS法等，QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）法是由Anastassiades等[14]于2003年提出，QuEChERS前处理方法相较于其他方法，操作简单、灵敏度高，已在农药残留、兽药残留等领域得到验证和推广。为此，本研究采用QuEChERS进行样品前处理，高效液相色谱串联质谱测定枇杷中氯苯嘧啶醇残留量，建立QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱测定方法，旨在为监测枇杷中氯苯嘧啶醇的残留量提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试剂 氯苯嘧啶醇标准品（农业部环境保护科研监测所，100 mg·L-1）;无水硫酸镁、氯化钠（西陇科学股份有限公司，分析纯）;N丙基乙二胺

[（PSA），德国CNW公司];乙腈、甲醇、丙酮（美国天地试剂公司，色谱纯）;甲酸（山东西亚化学工业有限公司，色谱纯）;试验用水为超纯水。

1.1.2 主要仪器设备 DIONEX Ultimate 3000Thermo TSQ Quantum Ultra EMR高效液相色谱串联质谱仪（美国ThermoFisher公司，带ESI源）;318K离心机（德国Sigma公司） ;QUINTIX612上皿式天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确吸取0.5 mL氯苯嘧啶醇标准品（100 mg·L-1）于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成5 mg·L-1的标准储备液，于0～4℃冰箱中避光保存备用。根据需要分别用乙腈或空白基质稀释成适当浓度的标准工作溶液，现配现用。

1.2.2 样品提取与净化 参考SN/T 4138-2015《出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基苯、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS气相色谱负化学源质谱法》[15]并适当改进，称取10 g（精确至0.01 g）枇杷样品置于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈、4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，涡旋混合2 min，于4 500 r·min-1的离心机中离心5 min。取上层有机相6.0 mL转移至装有0.30 g PSA、0.90 g无水硫酸镁的离心管中，涡旋振荡1 min，取1 mL过0.22 μm有机滤膜，待高效液相色谱串联质谱仪分析测定。

1.2.3 检测条件 （1）液相色谱条件。色谱柱为Atlantis T3 Column（100 mm×2.1 mm×3 μm）;流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈;进样量为2.0 μL;流速为0.25 mL·min-1;总运行时间为10 min;梯度洗脱程序见表1。（2）质谱条件。电喷雾正离子扫描（ESI+）;喷雾温度为260℃;喷雾电压为3 900 V;离子传输管温度为300℃;鞘气（N2）流速为3.58 L·min-1，辅助气（N2） 流速为5.74 L·min-1，扫描模式：SRM。

1.2.4 提取溶剂的选择 分别采用甲醇、丙酮、乙腈作为提取溶剂，其余操作步骤均按1.2.2的样品提取与净化进行，添加氯苯嘧啶醇标准溶液进行提取回收率试验，根据提取效果确定最佳提取溶剂。

1.2.5 方法有效性评价 准确吸取5 mg·L-1的标准储备液稀释，配制成0.5、1、5、10、50、100、200 μg·L-1的基质匹配标准工作溶液。以质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，评价方法的线性范围和灵敏度，外标法定量。在枇杷空白样品中添加3个水平的标准工作溶液进行添加回收试验，每个水平重复5次，按1.2.2方法进行操作，测定添加回收率和相对标准偏差（RSD），评价方法的准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

试验采用0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相，将氯苯嘧啶醇标准品稀释到1 mg·L-1，经注射泵注入质谱，选择ESI+模式，调节合适的注射泵流速及喷雾温度、电压等条件使响应值信号大于106，且响应达到稳定状态。先全扫描确定母离子，再选择反应监测模式（SRM）进行二级质谱自动优化，得到定性和定量离子及相应的碰撞能量，最终确定氯苯嘧啶醇的质谱检测参数（表2）。

2.2 提取溶剂的确定

农药残留检测前处理常用的提取剂较多，本试验考察了甲醇、丙酮、乙腈3种溶剂的提取效果，结果表明氯苯嘧啶醇（添加量为100 μg·kg-1）在这3种溶剂中的平均回收率分别77.2%、97.4%和98.6%，即丙酮、乙腈的提取效果优于甲醇。尽管在丙酮和乙腈溶剂中的回收率相差不大，但丙酮较易提取出其他杂质，为此，本试验优选乙腈作为提取剂。

2.3 方法的线性范围和灵敏度

由于样品中基质效应的存在，本试验采用基质匹配标准溶液来进行校正。通过向空白基质中添加不同浓度的标样，配制基质匹配系列标准工作溶液并进样分析，以标准工作溶液的质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标，在0.5～200 μg·L-1浓度范围内绘制标准曲线（图1）。氯苯嘧啶醇的线性回归方程为 y=14 799.6x-5 369.26（r2=0.999 4）， 线性关系良好。以信噪比（S/N）的3倍和10倍计算检出限和定量限，氯苯嘧啶醇检出限为0.14 μg·kg-1、定量限为0.5 μg·kg-1，可满足定量分析的要求。

2.4 方法的准确度和精密度

在枇杷空白样品中分别加入2、20和200 μg·kg-1 3个质量水平的标准工作溶液进行添加回收试验，重复5次。按上述方法进行前处理和上机测定，枇杷空白样品和加标样品的提取离子流色谱图见图2和图3，氯苯嘧啶醇保留时间为6.21 min;氯苯嘧啶醇的平均回收率为87.0%～97.4%、RSD为4.3%～8.3%（表3），表明该方法适用于枇杷中氯苯嘧啶醇的残留测定。

3 结论与讨论

本试验中供试的甲醇、丙酮、乙腈3种提取剂，甲醇的提取效果呈现最差，这可能与其较难与水层分离有关[16]。农产品中农药残留量的检测前处理，常见的净化剂有PSA、C18、GCB等，在试验中可以根据样品的特性来选择合适的净化剂。PSA主要用于除去基质中极性物质如糖类、有机酸、脂肪酸及亲脂性色素等极性物质[17];C18可以去除脂肪酸、脂类等非极性干扰物[18];GCB对色素有较强的吸附净化能力，但会吸附一些平面及对称结构的农药，影响农药的回收率[19]。枇杷样品提取液颜色极浅，色素、脂类等干扰物较少，为此，本试验中在净化时加入PSA就能达到较好净化效果。

关于农产品中氯苯嘧啶醇残留检测方法的研究，王姗姗等[13]建立的QuEchERS超高效液相色谱串联质谱法，测定草莓中氯苯嘧啶醇的检出限为0.5 μg·kg-1;梁睿等[12]建立的苹果中氯苯嘧啶醇残留检测方法，测定枇杷中氯苯嘧啶醇的检出限为<0.3 μg·kg-1。本试验建立的QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱检测方法，对枇杷中氯苯嘧啶醇的检出限可达0.14 μg·kg-1、定量限为0.5 μg·kg-1，平均回收率为87.0%～97.4%、RSD为4.3%～8.3%。对枇杷中氯苯嘧啶醇的检出限可达0.14 μg·kg-1、定量限为0.5 μg·kg-1，平均回收率为87.0%～97.4%、RSD为4.3%～8.3%，符合NY/T 788-2018《農作物中农药残留试验准则》[20]规定的要求。同时，根据GB 2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[21]规定，枇杷中氯苯嘧啶醇的MRL为0.3 mg·kg-1，能满足于GB 2763-2019的要求。由上表明，本试验所建立的枇杷中氯苯嘧啶醇残留量分析方法，样品经乙腈提取、N丙基乙二胺（PSA）净化、高效液相色谱串联质谱测定，方法简单快速、灵敏度高，能够满足残留检测要求。

参考文献：

[1]王宁.氯苯嘧啶醇的合成[J].现代农药，2005，4（3）：17-18.

[2]王丹军，岳永德，汤锋，等.7种农药和5种表面活性剂对氯苯嘧啶醇光解的影响[J].安徽农业大学学报，2007，34（1）：45-48.

[3]王丹军，岳永德，汤锋，等.杀菌剂氯苯嘧啶醇的环境转归研究进展[J].安徽農业大学学报，2008，36（22）：9699-9701.

[4]孙家隆，齐军山.现代农药应用技术丛书.杀菌剂卷[M].北京：化学工业出版社，2015：123-124.

[5]魏云潇，何良兴.塘栖枇杷重金属和农药残留及套袋对品质的影响[J].浙江农业科学，2012，（4）：513-514.

[6]王丹军，岳永德，汤锋，等.几种表面活性剂和色素物质对氯苯嘧啶醇光化学降解的影响[J].安徽农业大学学报，2009，37（3）：1294-1297，1306.

[7]王丹军，岳永德，汤锋，等.氯苯嘧啶醇在水体中的光解机制研究[J].环境污染与防治，2008，30（7）：47-51.

[8]王丹军，岳永德，汤锋，等.氯苯嘧啶醇在有机溶剂中的光化学降解研究[J].安徽农业大学学报，2007，34（1）：40-44.

[9]王丹军，岳永德，汤锋，等.阴离子对氯苯嘧啶醇光化学降解的影响[J].农业环境科学学报，2008，27（5）：2023-2027.

[10] JACKSON R，LEWIS C.The metabolism of 14Cfenarimol soil[J]. Dow Elanco Reference， 1994（15）：32-45.

[11]梁睿，岳永德，汤锋.氯苯嘧啶醇在苹果中残留检测方法的研究[J].中国农学通报，2010，26（12）：57-62.

[12]梁睿，岳永德，汤锋.苹果中氯苯嘧啶醇残留检测方法的质量控制研究[J].安徽农业科学，2006，34（20）：5157-5158，5188.

[13]王姗姗，王莉，程媛媛，等.QuEchERS超高效液相色谱串联质谱法同时测定草莓中85种农药残留[J].浙江农业科学，2018，59（9）：1584-1591.

[14]ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and ″dispersive solidphase extraction″ for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAO International， 2003，86（2）：412-431.

[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫局.SN/T 4138-2015出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基笨、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS气相色谱负化学源质谱法[S].北京：中国标准出版社，2015：2.

[16]戴平望.超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶中5种农药残留量[J].理化检验-化学分析，2014，50（4）：508-511.

[17]李萍萍，张月，吴小芳，等.固相萃取法与QuEChERS法对比检测无核荔枝中19种农药残留[J].热带作物学报，2017，38（8）：1565-1571.

[18]高阳，徐应明，孙扬，等.QuEChERS提取法在农产品农药残留检测中的应用进展[J].农业资源与环境学报，2014，31（2）：110-117.

[19]李蓉，储大可，张朋杰，等.QuEChERS/HPLCMS/MS法测定黄瓜、菜心、葡萄、香蕉中127种农药残留[J].分析测试学报，2015，34（5）：502-511.

[20]中华人民共和国农业农村部.NY/T 788-2018农作物中农药残留试验准则[S].北京：中国农业出版社，2018：5.

[21]中华人民共和国国家卫生健康委员会，中华人民共和国农业农村部，国家市场监督管理总局.GB 2763-2019食品安全国家标准食品中农药最大残留限量[S].北京：中国农业出版社，2019：162.

（责任编辑：柯文辉）