大将逐瘀汤治疗胸腰椎骨折早期肠麻痹作用机制网络药理学研究

吴思贤，钟远鸣，李智斐，吴卓檀，何炳坤，万 通，钟锡锋

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001)

中医学认为肠麻痹的发生是由于脊椎骨骼遭受外力，骨断筋离，血溢脉外，败血留滞肠道，腑气升降失常，发为本病[1]。大将逐瘀汤是洛阳郭氏正骨流派的经典名方，原方由大黄、生姜、槟榔三味药物组成，具有攻下散瘀、行气止痛的功效。方中大黄善入血分，荡涤凝滞败血；槟榔善行肠胃之气，消积导滞，兼能缓泻通便；配以生姜防止大黄寒凉伤脾胃，诸药合用共奏攻下祛瘀、通利大便之功[2]。我院骨科继承和发展了平乐正骨流派的精髓，已开展相关的临床研究证实大将逐瘀汤治疗脊柱骨折疗效较好[3-5]。然而，并未对其具体的作用机制深入研究，究其原因主要是其治疗机制复杂，单一成分或者靶点的研究，往往不能充分体现出中药复方治疗疾病的潜在作用机制。网络药理学的出现为中药微观研究提供了新契机，它利用生物信息科学、药理学、计算机技术等多学科知识体系构建了药物成分疾病靶点的复杂网络[6]。本研究旨在揭示大将逐瘀汤改善胸腰椎骨折初期肠麻痹症状的潜在作用机制，为临床用药及进一步药理学实验研究提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 文献来源与分析平台 中药系统药理数据库(Traditional Chinese medicine systems pharmacology,TCMSP)、Uniprot数据库、人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian inheritance man,OMIM) 数据库、Gene Cards数据库、Pubchem数据库、RCSB蛋白质数据库、R软件、Strawberry Perl软件、Cytoscape软件、String平台、Auto Dock Tools软件。

1.2 研究方法

1.2.1 药物活性成分及靶点蛋白筛选：利用TCMSP数据库搜索大将逐瘀汤中大黄、生姜、槟榔所含有的活性化合物，以生物口服利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为筛选标准，收集大黄、生姜、槟榔的活性成分[7]。根据TCMSP数据库化合物靶点识别功能，筛选出所有药物潜在活性成分的作用靶点，最后通过Uniprot数据库及Strawberry Perl软件为筛选出来的靶点添加官方简化名称。

1.2.2 收集大将逐瘀汤活性成分与胸腰椎骨折早期肠麻痹疾病共同靶点信息：基于OMIM数据库和Gene Cards数据库，以“Intestinal obstruction”“ileus” 为检索关键词，检索时间截止于2020年7月，合并各个数据库的检索结果，去除重复的疾病靶点后，利用R软件将数据整合，与药物靶点取交集构建韦恩图。

1.2.3 构建药物-活性成分-疾病靶点网络图：将上述获得的大将逐瘀汤活性成分、药物与疾病交集的靶点信息导入Cytoscape软件进行一一映射，将结果可视化获得药物-活性成分-疾病靶点网络图，再通过Cytoscape软件中Cyto NCA工具对复方活性成分的Degree值进行计算，Degree值越高，说明该活性成分在网络中发挥的作用越明显。

1.2.4 蛋白互作网络(PPI网络)构建：将药物作用靶点与疾病靶点取交集后获得的共同靶点导入蛋白质相互作用String平台，物种选择人类(Homo sapiens)，最低互作分值设置为0.70，并去除边缘游离的靶点，下载tsv文件，将构建好的网络导入Cytoscape软件，根据插件Cyto NCA对疾病的靶点打分，取得分高者作为核心靶点。

1.2.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析：将获得的药物-疾病交集靶点通过R语言软件进行GO功能分析和KEGG 通路分析。

1.2.6 分子对接：将上述过程获得的Degree值排名前三的复方潜在活性化合物作为核心配体蛋白，于Pubchem数据库下载其相应的3D结构导入Chem Bio3D Ultra 14.0软件中输出格式为pdb的文件。将PPI网络中Degree值前三的靶点作为此次分子对接的核心受体蛋白，通过RCSB蛋白质数据库中搜索并下载其3D结构，利用PyMOL软件去除受体蛋白中原有小分子配体及水分子，最后将文件保存为pdb格式。将上述处理完毕的核心配体蛋白与核心受体蛋白pdb文件导入Auto Dock Tools软件工具进行活性口袋分析，最后选择Auto Dock Vina对接工作软件进行配体与受体的对接，将本次核心配体蛋白对接至去除小分子配体的核心受体蛋白中。分子对接稳定性的判定标准为当二者对接结合能<0 kcal/mol时，表明受体与配体对接具有良好的亲和力，提示结合越稳定。

2 结 果

2.1 药物活性成分及靶点蛋白信息 依据筛选条件收集后发现大将逐瘀汤共有29种潜在活性成分，其中槟榔8种、大黄16种、生姜5种，见表1。据TCMSP数据库化合物靶点识别功能，筛选出所有药物潜在的作用靶点蛋白，并利用Strawberry Perl软件对药物活性成分相对应的靶点蛋白进行整合，共获得靶点226个。最后通过下载Uniprot数据库的基因蛋白，过滤条件为“Reviewed”“Homo sapiens”，采用Perl软件为筛选出来的靶点转化为官方基因名称，剔重后获取靶点基因71个。

表1 大将逐瘀汤部分潜在活性成分信息

2.2 大将逐瘀汤活性成分与胸腰椎骨折早期肠麻痹疾病共同靶点信息 通过Gene Cards数据库和OMIM数据库共获取的疾病靶点数目为6647个，将这些靶点与大将逐瘀汤潜在活性成分作用靶点通过R语言软件进行一一映射，排除重复项的疾病靶点，得到交集靶点共60个，并构建药物-疾病靶点韦恩图。其中绿色代表药物(Drug)靶点、粉色代表疾病(Disease)靶点，相交部分为交集靶点(图1)。

图1 大将逐瘀汤活性成分与胸腰椎骨折早期肠麻痹疾病靶点韦恩图

2.3 药物-活性成分-疾病靶点网络构建信息 将上述筛选获得的137个药物-疾病交集靶点与复方药物潜在活性成分通过Strawberry Perl软件进行整合，生成相应的关系网络和相关属性文件，并导入Cytoscape软件，进行可视化分析得到药物-活性成分-疾病靶点网络图(图2)。图中黄色代表大黄活性成分，红色代表槟榔活性成分，绿色代表生姜活性成分，黄色和绿色重合提示有两种及以上药物共同构成的活性成分。右侧紫色代表交集靶点，节点间连线越多，代表该成分或靶点作用越大。利用Cytoscape软件中插件“CytoNCA”计算药物潜在活性成分对应的Degree值，该值越大，表明活性成分在治疗肠麻痹过程中发挥的作用越明显。通过计算Degree值排名前三的活性成分分别为β-谷甾醇 (β-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、芦荟大黄素(Aloe-emodin)，对应的Degree值分别为25、23、19，提示以上化合物在该网络中处于核心地位。

2.4 活性成分-疾病共同靶点PPI网络图 通过String蛋白互作平台得到大将逐瘀汤活性成分与胸腰椎骨折早期肠麻痹疾病共同靶点PPI网络图(图3)。该网络图共计有60个节点，相互作用关系由145条接触线构成，PPI富集P<1.0×10-16，平均局部聚类系数为0.46，平均节点度值4.83。图中每个节点表示一个蛋白，节点上标记的字母为对应靶点的gene symbol，节点之间的连线表示两个蛋白具有相互作用。若某一靶点Degree值超过平均节点度值，则该靶点在此网络处于核心地位，在治疗上发挥主要作用。本次计算结果中，超过平均节点度值的靶点共有52个，其中排名前五的靶点为TP53、JUN、CASP3、ESR1、MYC，对应的Degree值分别为：20、14、13、12、12。

2.5 共同靶点GO功能富集分析结果 共同靶点经过GO功能分析得到1490种生物学过程(Biological process，BP)、39种细胞组分(Cellular component，CC)、138项分子功能(Molecular function，MF)。图4列出了排名前10的条目，颜色越红，圆圈越大，说明该基因富集程度越高。由图可知，大将逐瘀汤活性成分与胸腰椎骨折早期肠麻痹疾病共同靶点主要分布于脂筏、细胞膜微结构、膜区等组分中；主要通过类固醇激素受体活性、G蛋白偶联受体活性、核受体活性等方式参与药物反应、糖皮质激素反应、营养水平反应、氧化反应、转录调控DNA模板等生物过程。

图4 共同靶点GO富集分析气泡图

2.6 共同靶点KEGG通路富集分析结果 通过R语言软件包对共同靶点进行KEGG通路富集分析，进行可视化分析得到气泡图(图5)。图中气泡形状和大小代表该通路富集的靶点基因数目，通路上富集的基因越多，则形状越大，颜色代表P值，P值越小，颜色越鲜红，P值越大，颜色越蓝。结果显示，神经活性配体-受体相互作用、乙型肝炎通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、钙离子信号通路等160条信号通路与大将逐瘀汤治疗胸腰椎骨折后早期肠麻痹关系密切。

图5 共同靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.7 分子对接结果 将药物活性成分-疾病靶点网络图中获取的Degree值排名前三的药物潜在活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素作为本次分子对接的核心配体。对应PPI蛋白互作网络中Degree值前三位的核心靶点TP53、JUN、CASP3作为核心受体。受体与配体对接结果见表2，表内的CID为该有效化合物在Pub Chem数据库的编码，结合能越低，说明配体与受体结合越稳定。将部分配体受体对接情况近一步可视化得到图6。

表2 受体与配体对接结果

A：aloe-emodin与JUN；B：aloe-emodin与T53；C：stigmasterol与T53

3 讨 论

脊柱骨折是常见的骨骼肌肉系统损伤，其中大部分发生在胸椎和腰椎，近75%～90%累及胸腰段[8]。骨折发生后由于局部血肿的形成和炎症反应，对腹膜后的交感神经造成压迫与刺激，致使胃肠蠕动、推进功能减退，临床上表现为腹部胀满、腹痛、大便不通、恶心欲吐，称之为肠麻痹[9]。一旦处理不及时，肠道严重胀气可压迫膈肌出现呼吸困难，下腔静脉回流受阻引起深静脉血栓，严重影响患者的预后，因此早期干预改善症状尤为重要[10-11]。治疗上大多采用直肠灌注开塞露或利用甘露醇的高渗作用增加肠道水分，刺激消化道，促进排便，但甘露醇在消化道内会释放气体，导致腹压增高，进一步加重腹痛、腹胀等症状，有造成肠损伤的风险，使患者难以接受[12]。

本文基于网络药理学研究方法，探讨了大将逐瘀汤防治胸腰椎骨折早期肠麻痹的分子作用机制。胸腰椎骨折合并肠麻痹时，肠黏膜所发生的一系列病理变化过程及临床症状与中医学理论上“瘀”及“不通则痛”的理论不谋而合。大将逐瘀汤以大黄为君药，直降下行，荡涤凝滞败血；配以槟榔，辛散苦泄，善行肠腑之气，消积导滞；佐以生姜防大黄寒凉伤脾胃[13]。β-谷甾醇主要获取途径是通过胃肠道吸收，该物质通过调控下丘脑-垂体-肾上腺激素轴以达到类激素样抗炎作用[14]。肖志彬等[15]发现β-谷甾醇具备强大的氧自由基清除能力，能提高血清中一氧化氮水平，抑制病灶周围肿瘤坏死因子的聚集与释放，达到抗炎、镇痛的作用。ERK1/2通路是参与多种细胞生命活动(如细胞凋亡和癌变)的重要信号转导途径之一，当机体组织处于缺血、缺氧状态时，ERK1/2途径显著增加[16]。严宁等[17]认为β-谷甾醇能下调ERK1/2，有效抑制细胞的凋亡，从而减轻组织的缺血再灌注损伤。芦荟大黄素能刺激肠壁的蠕动，同时由于渗透压的变化，利于推进肠内粪便，从而达到刺激性腹泻的目的[18]。大黄的蒽醌衍生物大黄酚-8-葡萄糖苷能抑制胶原和凝血酶，从而拮抗血小板聚集，在体外动物试验中可抑制血小板聚集并拮抗血栓素α2的形成[19]。大将逐瘀汤方中的主要成分豆甾醇、儿茶素同样具备抗氧化、清除自由基、抗炎等作用[20]。大将逐瘀汤充分体现了“以通为用”的治法，不但逐瘀泻下，有效缓解因局部血肿压迫和炎症刺激引起的肠道黏膜瘀血，又能行气通滞，促进肠蠕动，建立保护屏障，形成良性循环，改善胃肠症状。

大将逐瘀汤中的各种活性成分存在紧密的协同关系，PPI网络图包含了60个作用节点及145条相互联系线。核心靶点基因包括TP53、JUN、CASP3、ESR1、MYC，其中TP53、CASP3是调控细胞凋亡过程中重要的相关基因，可引起蛋白解酶级联反应，主要介导细胞凋亡[21]。椎体骨折后出血和腹胀会引起腹内压的增高，对窦椎神经或背根神经形成机械压迫，造成神经节水肿、变性，引起腹痛，JUN是一种核内原癌基因，对神经修复和再生具有积极作用。体外动物研究表明，由JUN和转录-3激活剂组成的二聚体刺激了模型神经元和背根神经节神经元的轴突生长[22]。ESR1靶点可调节缺氧诱导因子信号、5-羟色胺和一氧化氮代谢等通路发挥抗缺氧作用[23]。GO功能富集分析显示，大将逐瘀汤治疗肠麻痹与药物反应、糖皮质激素反应、营养水平反应、氧化反应等生物过程关系密切。中枢神经和脊髓的调控失能、炎症协调机制、药理相互作用均可对胃肠道平滑肌的收缩造成影响，大将逐瘀汤可通过以上生物过程发挥抗炎、抗氧化、营养神经、促进胃肠平滑肌蠕动的功能。KEGG富集分析涉及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、乙型肝炎通路、钙离子信号通路等。钙离子信号通路可以调节有氧代谢，引起小肠肠道平滑肌细胞和Cajal间质细胞细胞膜去极化,促进Ca2+内流,改善平滑肌舒缩功能,从而促进肠道蠕动和排空，以达到缓解肠麻痹症状的目的[24]。这为防治胸腰椎创伤后肠麻痹提供了新的研究靶点与思路。本次选择活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、芦荟大黄素作为配体，核心靶点TP53、JUN、CASP3作为受体进行分子对接。3个核心配体与3个核心受体两两对接后结合能均<0 KJ/mol，表明配体与受体对接后结合稳定，具有良好的亲和力，这为大将逐瘀汤防治胸腰椎性骨折早期肠麻痹奠定分子理论基础。

综上，本次研究表明大将逐瘀汤可通过29个活性成分作用于71个防治靶点调控160条信号通路来发挥抗炎镇痛、改善微循环、恢复胃肠道蠕动的作用。体现了中药复方在配伍上具备优势互补、协同增效的特点，同时也揭示了中药复方多成分-多靶点-多通路治疗疾病的本质，为临床防治胸腰椎性骨折早期肠麻痹及进一步分子实验研究提供参考。受筛选条件限制，本研究具有一定局限性，因只选择了方中的关键活性成分、治疗靶点及相关通路进行研究，未来仍需进行相关药理学研究进一步补充说明。