肿瘤浸润淋巴细胞在不同分子亚型乳腺癌新辅助化疗中的作用

谢芳 马骖 吴玲玲 单宏杰 马强 黄赞

安徽医科大学附属宿州医院，宿州市立医院1肿瘤外科，2病理科（安徽宿州234000）

乳腺癌的发病率正在逐年升高，且发病人群逐渐年轻化，成为威胁女性生命健康的罪魁祸首［1-3］。它的发生、发展与环境、遗传以及肿瘤所处的微环境等一些复杂分子生物学因素密切相关，免疫系统在此过程中也起着重要调控作用［4-5］。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）是以淋巴细胞为主的存在于肿瘤癌巢内及间质中的异质性淋巴细胞群体。TILs 的出现，是宿主免疫系统对肿瘤抗原免疫应答的标志，反映了肿瘤局部发生的免疫反应，肿瘤原发灶中TILs的水平反映了机体的抗肿瘤能力，其数量也预示着肿瘤的治疗效果［6］。乳腺癌的新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）可以使肿瘤降期降级，提高保乳率及手术R0 切除率，是乳腺癌综合治疗的重要组成部分。选取敏感适宜可量化的分子标志物，准确评估个体NAC 的疗效，以避免无效治疗延误患者病情，是当今研究的热点。本研究通过计算不同亚型乳腺癌患者NAC 前粗针穿刺标本中的TILs 比例、术后病理学评估大体标本的化疗反应并进行统计学分析，来探讨TILs 比例能否作为NAC 疗效预测的一个可靠的生物学指标，从而辅助决策乳腺癌病患NAC 方案，以期实现精准个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2019年7月至2020年7月期间我院肿瘤外科56 例乳腺癌患者的临床病理资料，入院均予粗针穿刺活检确诊后行NAC 后完成手术。患者均为女性，年龄31 ～69 岁，中位年龄47 岁，肿瘤最大径1.8 ～6.0 cm，中位直径3.4 cm，临床分期Ⅱ期24 例，Ⅲ期32 例，分子亚型Luminal型17 例，HER-2 阳性20 例（包括HR 阳性及HR阴性），三阴性16 例，3 例患者因免疫组化HER-2（2+）未行cerbB2 基因检测，故未分型。所有患者均签署知情同意书，予含蒽环类和/或紫杉类药物方案的NAC，15 例HER-2 阳性患者NAC 联合靶向治疗，中位化疗次数4 次。

1.2 TILs 比例计算TILs 可分为肿瘤内浸润性淋巴细胞（iTILs）和肿瘤间质浸润性淋巴细胞（sTILs），以及少量侵犯肿瘤边界的浸润性淋巴细胞（imTILs）［7］。国际TILs 评价工作组目前推荐以sTILs 应用于临床研究工作［8］。利用HE 染色方法对新辅助化疗前穿刺的癌组织标本进行染色，200 高倍镜视野下计算出肿瘤癌巢内及间质中含TILs 的面积与肿瘤总面积的百分比，取其均值定义为TILs 比例。并根据比例大小分为低、中、高三组，TILs 比例≤5%为低比例组，TILs 比例在6%～49%为中比例组，TILs 比例≥50%为高比例组。

1.3 新辅助化疗疗效评价标准根据日本乳腺癌协会分类评估系统（2007年）评估术后大体标本的新辅助化疗疗效。根据组织学改变将化疗反应分为0 级、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级共4 个等级。0 级：无效应，癌细胞在治疗后几乎无变化；Ⅰ级：轻微反应，癌组织有变化但占总面积的2/3 以下；Ⅱ级：明显反应，癌组织有明显变化达到或超过总面积的2/3，但仍有明确癌细胞残留；Ⅲ级：完全反应，所有癌组织坏死或消失、被肉芽组织或纤维组织替代，或仅残留少量导管内癌成分。病理疗效评估由两位高年资病理医师共同阅片完成。

1.4 统计学方法应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验或Fisher′s 确切概率法。多因素分析采用有序多分类logistic 回归。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新辅助治疗的疗效56 例乳腺癌患者中有15例患者NAC同时联合曲妥珠单抗靶向治疗，NAC方案均含蒽环类和/或紫杉类药物，所有患者在完成2 ～6 个疗程治疗后行手术治疗。术后根据大体标本中肿瘤组织的化疗反应进行疗效评价，结果显示NAC 的总体有效率为76.8%（43/56），有13 例患者化疗反应为0 级，提示NAC 无效；24 例患者化疗反应为Ⅰ级，占比42.9%；12 例患者化疗反应为Ⅱ级，占比21.4%；7 例患者化疗反应为Ⅲ级，占比12.5%。

2.2 各临床病理因素与乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性本研究显示，患者行新辅助治疗前的临床分期、腋窝淋巴结以及ER、PR、HER-2 状态、Ki-67 指数与化疗反应无明显相关性（P＞0.05）。术后病理学评估显示TILs 高比例组的癌组织化疗反应达到Ⅱ级或Ⅲ级的比例要高于TILs 低比例组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。提示较高的TILs 比例与乳腺癌NAC 的疗效相关，可以预测乳腺癌新辅助化疗疗效，这与既往研究［9-12］一致。图1 为HE 染色方法检测的癌组织中具有代表性的化疗反应为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级和TILs 低、中、高比例的图片。

图1 HE 染色方法检测的肿瘤组织中TILs 低、中、高比例及化疗反应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级镜下表现（×200）Fig.1 Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲgrades of responses to chemotherapy and Low-，intermediate-，and high-fraction of TILs were detected in breast tumors by using hematoxylin and eosin staining（×200）

表1 56 例乳腺癌患者的临床病理因素与新辅助化疗疗效的关系Tab.1 Relationship between clinicopathological factors and response to chemotherapy in 56 patients with breast cancer

2.3 乳腺癌的分子亚型与TILs 比例的关系本研究入组了56 例患者，3 例患者免疫组化HER-2（2+）未行cerbB2 基因FISH 检测，未行分子分型也未行靶向治疗。53 例患者中分子亚型为Luminal型17 例，HER-2 阳性20 例，三阴性16 例。结果发现，13 例新辅助化疗无效的患者以Luminal 型和HER-2 阳性为主，TNBC 患者肿瘤组织中的TILs 比例明显高于Luminal 型及HER-2 阳性乳腺癌（P＜0.05），见表2。故推测无论何种类型乳腺癌，TILs比例与NAC 疗效相关，在TNBC 中更为明显，TILs有可能成为TNBC 免疫治疗的一个潜在靶点，这也与研究［13］一致。

表2 53例乳腺癌分子亚型与穿刺标本中TILs比例的关系Tab.2 Relationship between TILs levels and molecular subtypes in 53 patients with breast cancer

2.4 新辅助化疗疗效的多因素分析Logistic 回归分析结果显示，年龄、ER、PR 及HER-2 状态、Ki-67 指数与化疗反应无明显相关性。相较于低比例组，TILs 高比例为化疗反应一个独立的预测因子（OR= 0.04，95%CI：0.007 ～0.230；P＜0.05），见表3。

表3 各临床病理因素与新辅助化疗疗效的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of predictive factors for the response to chemotherapy

3 讨论

NAC 在乳腺癌综合治疗中占重要地位，现已广泛应用于临床，其不仅能使局部晚期患者达到可手术标准、使初诊不能保乳患者获得保乳的机会，还能预知肿瘤对化疗药物的敏感性，指导临床化疗药物的选择。尽管现有证据显示NAC 总体上并不改善患者的预后［14］，但患者治疗后如能达到病理学完全缓解（pCR），提示预后可能改善［15］。目前临床尚缺乏合适的分子标志物来准确评估个体NAC 的疗效。TILs 作为可以量化测量的敏感生物标志物，可行性和再现性高，可较好地应用于NAC 中。

1992年，AALTOMAA 等［16］发现乳腺癌原发病灶内淋巴细胞的浸润预示着较好的预后。随着肿瘤免疫学的发展，BIG2-98、ECOG2197 试验等多项研究［17-19］均论证了TILs 在早期乳腺癌中的预后价值。2016年圣安东尼奥乳腺癌大会上的一项针对3 771 例乳腺癌NAC 患者的Meta 分析显示，对于乳腺癌所有的分子亚型，TILs 都是pCR 强有力的预测标志，TILs 比例越高，pCR 率越高，在TNBC中这种高pCR 率可以延长患者DFS，转为生存获益。随着对TILs 研究［10-12，20］的深入，专家们认为，在Her-2 阳性和TNBC 乳腺癌NAC 中TILs 能提高pCR 率，且与预后（EFS、DFS、OS）密切相关。而在ER 阳性和HER-2 阴性乳腺癌中，TILs 的预后和预测作用仍有争议［21-22］。目前国内相关研究仍不多，且多为回顾性，也少有研究对所有患者的分子分型进一步亚组分析。本研究为前瞻性研究，研究结果发现较高的TILs 比例可以预测乳腺癌新辅助化疗的疗效，基于分子分型的亚组分析显示TNBC患者肿瘤组织中的TILs 比例明显高于Luminal 型及HER-2 阳性乳腺癌患者。TNBC 相较于其他亚型缺乏明确的分子靶标，且其恶性程度高、侵袭性强、复发率高，治疗效果常常不理想，临床实践中治疗选择甚少［23］。据本研究推测，TILs 有望成为TNBC 免疫治疗的一个潜在靶点。多因素分析结果显示，患者的化疗反应与较高的TILs 比例明确相关，而与年龄、ER、PR 及HER-2 状态、Ki-67 指数无相关，提示TILs 比例是乳腺癌NAC 疗效的独立预测因子。由于研究条件及随访时间有限，纳入的病例数较少，且不同患者NAC 药物及疗程有所差异，也会导致结果存在一定的偏倚。另外，相关研究［24-25］表明，TILs 分布的异质性、TILs 在肿瘤中的空间结构、以及不同的TILs 亚群都会影响TILs在抗肿瘤免疫中的作用。本研究未能筛选出TILs亚群进一步分析，也会影响研究结果。

今后将会扩大样本量，延长随访时间，完善TILs 的评估机制，引用最新数字病理学技术来代替人工量化，使TILs的评估方法更准确、更客观；进一步细化研究工作，希望通过对针对不同TILs 亚群分层研究进一步深入了解，将其纳入风险预测模型，以期在不久的将来应用于常规临床实践，指导辅助化疗决策，更准确地预测在新辅助环境中实现pCR 的机会，指导临床为患者实施精准个体化治疗，改善患者远期预后。