宫颈癌患者癌组织中IL-33表达水平与临床病理特征及预后的相关性

苏博 闫振宇 郝尚辉 孙丽 忽平 高毅

南阳市中心医院1病理科，3妇产科，4麻醉科（河南南阳473000）；2新乡医学院第一附属医院妇产科（河南新乡453000）

2010-2013年，河北省宫颈癌粗发病率为14.62/10 万例，死亡率为3.74/10 万例，死亡率呈现下降趋势，但发病率呈现上升趋势［1］，国家癌症中心研究数据显示［2］，2015年中国宫颈癌新发患者高达近10 万例，死亡患者3 万例左右，宫颈癌已严重影响女性健康。尽管高危型人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持续性感染是导致宫颈癌发病的病理生理基础，但仅仅部分患者可发展为宫颈癌［3］，单纯从HPV 感染角度难以完全解释宫颈癌的具体发病机制。白细胞介素-33（interleukin-33，IL-33）属于内皮细胞分泌的一种细胞因子［4］，IL-33作为一种促炎因子参与了多种恶性肿瘤如卵巢癌［5］、子宫内膜癌［6］等发病机制，本课题组前期研究也证实IL-33 可作为宫颈癌的一项生物学标志物［7］，但目前关于宫颈癌组织中IL-33 的表达水平尚不清楚，本研究在前期研究的基础上，进一步分析宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平与临床病理特征及预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入2016年1月1日-2017年12月31日于南阳市中心医院妇产科确诊的184 例宫颈癌患者作为研究对象，年龄52 ～61 岁，平均（58.25±7.22）岁；肿瘤大小＜4 cm共83例，≥4 cm 共101 例；鳞癌共137 例，其他病理类型共47 例；肿瘤细胞中～高分化共61 例，低分化共123 例；肌层浸润深度＜1/2 共56 例，肌层浸润深度≥1/2 共128 例；FIGO 分期中Ⅰ期共63 例，Ⅱa 期共121 例；发生淋巴结转移共104 例，未发生淋巴结转移共80 例。纳入标准：（1）宫颈癌诊断通过术后组织病理学诊断；（2）初次来我院就诊并确诊，宫颈癌为早期，FIGO 分期为Ⅰ～Ⅱa 期，且入院后采用广泛子宫切除及盆腔淋巴结清扫术；（3）临床资料完善。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤及宫颈癌远处转移等；（2）患有严重肝肾功能不全、血栓性疾病及其他不适合手术的疾病等；（3）合并其他自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、白塞病等；（4）术后失访。所有患者术后每1 个月进行门诊复诊或电话随访，必要时进行影像学检查，终止日期为患者复发、死亡日期或末次随访日期，本研究中末次随访截止日期为2020年12月31日，随访时间定义为手术后至复发、死亡时间或截止时间。宫颈癌患者术后复发或死亡定义为预后不良，其余定义为预后良好。本研究经过我院伦理委员会审核并批准。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂鼠源性IL-33 单克隆抗体购买于北京义翘神州科技股份有限公司（货号：10368-HNAE，产地：中国）。SP免疫组化染色试剂盒及二抗（HRP标记羊抗鼠IgG）购买于上海碧云天生物试剂有限公司（上海，中国）。

1.2.2 宫颈组织中IL-33表达水平手术获取宫颈癌患者癌组织和癌旁组织（距离癌组织3 cm 以上），癌组织和癌旁组织中IL-33 表达水平采用免疫组化法检测。取我院病理科石蜡包埋的切片，连续切片后制成4 μm 厚度切片，常规进行脱蜡和水化，柠檬酸钠缓冲液加热进行抗原修复，3%过氧化氢溶液室温孵育15 min 用于阻断内源性过氧化物酶，再次采用PBS 洗涤3 次，每次3 min。10%山羊血清室温封闭30 min，滴加一抗后4 ℃孵育过夜，复温后PBS 洗涤3 次，每次3 min，滴加二抗室温孵育30 min。切片用DAB 显色，苏木精复染。切片冲洗干燥后中性树胶封片。以已知阳性反应片作为阳性对照，以PBS 作为一抗用于阴性对照。参考文献［8］，免疫组化结果按照如下判定：IL-33 抗原阳性反应为细胞胞浆中出现黄色颗粒，与背景对比，无色、浅黄色、棕黄色和棕褐色分别得0 分、1 分、2 分和3 分；阳性细胞数得分：随机采集10 个代表性的视野计算阳性表达率，阳性表达率为阳性细胞数/肿瘤细胞总数*100%，阳性表达率5%、5% ～25%、26% ～50%、51% ～75%及75%以上分别得分0 分、1 分、2 分、3 分和4 分。染色强度得分*阳性细胞数得分为0 ～1 分、2 ～3 分、4 ～5 分和≥6 分时分别计为阴性（-）、弱阳性（+）、中度阳性（++）和强阳性（+++），本研究中将“++～+++”视为高表达，将“-～+”视为低表达。

1.2.3 临床病理资料的收集所有研究对象年龄、产次、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、肌层浸润深度、FIGO 分期、淋巴结转移等。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用频数或百分比表示，采用卡方检验，宫颈癌患者不良预后的危险因素采用Cox 风险比例模型分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达及分布本研究中宫颈癌患者癌旁组织中IL-33 均为低表达，癌组织中IL-33 高表达共126 例，低表达共58 例。IL-33 主要表达于细胞胞浆中，呈现棕黄色及棕褐色颗粒。结果见图1。

图1 宫颈癌组织中IL-33 表达情况（×200）Fig.1 IL-33 expression level cervical cancer tissues（×200）

2.2 宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平与临床-病理特征的关系宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平在分化程度、肌层浸润深度、FIGO 分期和淋巴结转移上差异存在统计学意义（P＜0.05），而与年龄、产次、肿瘤大小及组织学类型无明显相关性。结果见表1。

表1 宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平与临床-病理特征的关系Tab.1 The relationship between the expression level of IL-33 and the clinical-pathological characteristics in cervical cancer tissues例

2.3 宫颈癌患者术后预后不良和癌组织中IL-33表达水平的关系本研究中随访时间为5 ～60 个月，中位随访时间为37.25 个月。截止到随访结束，本研究中宫颈癌患者复发或死亡共141 例，未复发或死亡43 例，其中复发或死亡患者癌组织中IL-33 高表达103 例，低表达38 例，未复发或死亡患者癌组织中IL-33 高表达23 例，低表达20 例，预后不良与预后良好组患者癌组织中IL-33 表达水平差异存在统计学意义（P=0.016）。

2.4 Cox 回归分析Cox 回归分析结果显示，肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移和IL-33高表达是影响宫颈癌患者不良预后的危险因素（P＜0.001），见表2。

表2 宫颈癌患者不良预后的单因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of the poor prognosis of patients with cervical cancer

3 讨论

宫颈癌严重影响女性的生殖健康，尽管宫颈细胞学筛查对检测早期宫颈癌具有一定重要意义，但是仍无法抑制宫颈癌的发病风险［9］，随着近年来分子生物学的发展，多项研究致力于探讨宫颈癌的分子标志物［10］。IL-33 属于一种炎症介质，参与了多个生殖系统肿瘤的发病机制［5-6］，鉴于目前关于IL-33 和宫颈癌的相关性研究报道较少，本研究通过探讨宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平及其临床意义。

IL-33 属于白细胞介素1（interleukin-1，IL1）家族成员之一，其编码基因位于9 号染色体短臂上，IL-33 本质上属于一种促炎因子，表达于多种类型细胞如上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞中［11-12］，IL-33 通过其受体ST2 可参与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）等多种炎症信号通路的调节［13-14］，而炎症与肿瘤的发病机制密切相关［15］。ZHOU 等［16］发现，肿瘤相关成纤维细胞可分泌IL-33，IL-33 能通过其受体ST2 诱导上皮间质转化的发生而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，当IL-33 或ST2 基因沉默后可抑制这种现象的发生；此外，IL-33 能显著提促进肿瘤细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达和分泌［17］，VEGF 可受到M2型巨噬细胞的调控而参与肿瘤组织中新生血管的形成［18］。另一方面，IL-33 除了通过直接或间接促进肿瘤组织中的血管形成之外，也能通过作用于免疫细胞而影响肿瘤微环境，最终促进肿瘤的发生发展，JOVANOVIC 等［19］证实，当对乳腺癌小鼠模型中给予IL-33 后可抑制树突状细胞的成熟，促进免疫耐受并降低自然杀伤细胞的细胞毒性作用而促进肿瘤的生长和转移。本课题组前期研究证实［7］，宫颈癌患者血清中IL-33 表达水平显著升高，在临床分期、肿瘤细胞分化程度上存在显著差异，IL-33 单独诊断宫颈癌敏感度和特异度均可达80%以上，本研究进一步通过免疫组化分析宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平发现，癌旁组织中IL-33 均为低表达，癌组织中IL-33 大多为高表达，且宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平在分化程度、肌层浸润深度、FIGO 分期和淋巴结转移上存在显著差异（P＜0.05），这一结果与本研究前期结果基本相一致。目前关于IL-33 如何参与调控宫颈癌发病的具体分子生物学机制报道较少，HPV 持续性感染可导致宫颈癌的发生，但是具体机制不清楚，KULHAN 等［20］研究显示，宫颈组织中HPV 的持续性感染可能会诱导IL-33 高表达，最终通过多种信号途径促进宫颈癌的发生，此外，WANG 等［21］发现IL-33 也可诱导宫颈组织中IFN-γ表达上调而参与宫颈癌的发病机制。随访期间发现，宫颈癌组织中IL-33 高表达组复发或死亡风险显著高于低表达组，提示IL-33 高表达与宫颈癌患者的不良预后有关，本研究同时发现，肿瘤细胞低分化、肌层浸润深度越深、FIGO 分期越高和发生淋巴结转移的宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平均显著升高，肿瘤细胞分化程度越低，说明恶性程度越高，而肌层浸润深度越深和发生淋巴结转移，说明肿瘤细胞越容易进行局部侵袭和远处转移，FIGO 分期是综合多种因素进行预后评估，通常FIGO 分期越高，预后越差，刘海凤等［8］证实这些临床因素均是宫颈癌患者不良预后的指标之一，本研究进一步通过Cox 回归分析证实IL-33 高表达与宫颈癌患者不良预后有关。因此，笔者认为宫颈癌组织中IL-33 高表达与宫颈癌的发生发展密切相关，可作为评估宫颈癌预后的一种生物学标志物。

综上所述，宫颈癌患者癌组织中IL-33 表达水平显著升高，与宫颈癌的临床病理特征显著相关，对宫颈癌的发生发展及预后有着极其重要的意义，IL-33 也可作为筛查宫颈癌的一种生物学标志物，然而，日后IL-33 如何调节宫颈癌的发病机制仍是下一步继续研究的方向。