基于Zinc-ZIP8-MTF1轴研究独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制

赵小敏，李 多，朱明双，黄 勇，曹纪辉

(1.四川省南充市中医医院骨伤科，四川 南充 637001；2.成都中医药大学中医骨伤科学教研室/成都中医药大学附属医院骨伤科，四川 成都 610072；3.重庆市长寿区中医院骨伤科，重庆 401220)

膝关节骨性关节炎(KOA)主要以疼痛、活动受限为临床表现，其病理表现为软骨的变性破坏为主。目前学术界普遍认为KOA的发生与发展是一个慢性、长期、渐进且不可逆的病理过程。流行病学调查显示，KOA在全球的患病率为4%～13%，随着人口老龄化的进程加快，KOA患病率日渐增高[1]。传统中医药在治疗KOA中发挥着重要且不可替代的作用，其中独活寄生汤作为治疗KOA的经典名方，临床效果明显，在临床中为众多医家运用[2，3]。研究发现[4]，Zinc-ZIP8-MTF1轴的激活在膝骨关节炎软骨退变中发挥了重要作用。本课题组前期研究发现[5]，独活寄生汤可以抑制炎性状态下软骨细胞内Zn2+的浓度。本研究通过KOA模型动物，探索独活寄生汤在治疗膝骨关节炎中的作用机制，及与Zinc-ZIP8-MTF1轴在该机制中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料2018年5月至2020年12月本研究在岐黄博恩生物科技有限公司实验室完成。C57BL/6小鼠54只(均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002)。药品与试剂：独活寄生汤药液；水合氯醛；乙二胺四乙酸二钠盐；BCA蛋白浓度测定试剂盒；Anti-beta Actin antibody；二抗羊抗兔；Metallothionein Monoclonal Antibody；SLC30A9 Polyclonal Antibody；SLC39A8 Polyclonal Antibody；MTF1 Polyclonal Antibody；Animal Total RNA Isolation Kit；RT EasyTMⅡ；FluoZin-3 AM；Pluronic F-127；TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit；SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix；番红-固绿染液。

1.2 动物模型制作参考文献[6，7]制作，采用7%水合氯醛行腹腔麻醉实验小鼠，选取小鼠右后膝关节作为操作模型，采用聚维酮碘和酒精对小鼠右后膝关节消毒；在显微镜下用小尖刀取髌旁内侧切口显露膝关节，手术过程为减少失血，当有出血时，进行压迫止血，小心打开关节腔，注意操作过程中动作不可粗暴，不破坏膝关节内其它软组织，用钳子将髌骨向外侧脱位，在手术过程中，为防止关节软骨表明变干，可在关节软骨表面滴入无菌生理盐水，在确保不损伤关节软骨和韧带的情况下，用 10 号手术刀片切断膝关节内侧半月板，将髌骨复位，关闭切口前，给予 0.25%布比卡因1滴，滴于手术部位以减少术后疼痛，用6-0丝线逐层闭合切口，缝合皮肤，结束手术。

1.3 动物分组处理将54只小鼠随机分为独活寄生汤组(DHJST组)、对照组(Model组)、空白组(Control组)各18只。本实验选取造模4周时间点开始给药，DHJST组予独活寄生汤灌胃，Model组、Control组用0.9%氯化钠溶液替代。独活寄生汤剂量为1.86 g/ml×10 ml。每次灌胃后观察实验小鼠一般状态。在给小鼠灌胃4周后，脱颈处死实验动物，并分别取小鼠右后膝关节软骨检测相关指标。实验中，因意外死亡2只小鼠(Model组和DHJST组各1只)，实验结束后，将每组小鼠再分为两组，其中一组取小鼠完整膝关节用于病理学检查和Zn2+浓度检测，每组用于病理学检测8只，荧光染色检测3只，实时荧光定量(Real Time Quantitative PCR，RT-qPCR)检测3只和 Western blotting检测3只。

1.4 病理组织学检测用无菌手术刀切开右后膝关节周围皮肤，用无菌剪刀在右后膝关节上下各1 cm处将小鼠股骨、胫腓骨剪断，然后用无菌剪刀在不损伤膝关节和周围关节囊的基础上将膝关节周围肌肉小心剔除，放入中性甲醛液中固定，采用10%EDTA-2Na 将膝关节脱钙8周，固定小鼠膝关节脱水切片，滴加固绿染色3分钟左右，清洗切片1～3分钟，将多余的染料冲掉，在切片上滴加媒染剂处理10～30秒，再用自来水清洗1～3分钟，并在切片上滴加番红染液染色0.5～2分钟，直至软骨染着鲜红色后，用自来水清洗1～3分钟，最后脱水各3～5分钟回后封片。所有小鼠膝关节均按病理检验SOP程序严格操作。最后镜检对小鼠膝关节进行观察并采集图像，本研究采用关节炎经典评分标准OARSI对已采集图像进行等级评分，以区别不同组别之间的KOA严重程度[8，9]，该等级从轻到重分为6个等级。

1.5 荧光染色技术检测软骨组织内ZN2+将用于荧光染色经过脱钙的小鼠膝关节取出，放入预冷的冰冻切片机中(-20 ℃)，并制备10 μm厚的冰冻切片，然后采用5 μM FluoZin-3 AM和0.1% Pluronic F-127(Invitrogen)处理冰冻切片；30分钟后，PBS液中洗涤，PBS溶液中继续孵育30分钟，整个实验处理过程必须保持在恒温37 ℃。最后，通过荧光显微镜观察膝关节软骨细胞内Zn2+成像。以验证独活寄生汤在小鼠膝骨关节炎动物模型体内对软骨细胞 Zn2+浓度的影响。

1.6 RT-qPCR用无菌手术剪刀小心剪取小鼠胫骨平台内侧软骨组织，提取总RNA，测RNA溶度浓度和纯度，RT EasyTMⅡ试剂盒逆转录cDNA，检测目标mRNA相对表达量。对同一样品中每个差异表达的 mRNA 的表达量进行归一化处理。测定锌转运蛋白(ZIP8、ZNT9)、金属调节转录因子(MTF1)、基质金属蛋白酶-3(MMP3)、基质金属蛋白酶-13(MMP13)mRNA的表达量。

1.7 Western blotting采用液氮研磨法，将膝关节软骨放入研钵，不断将液氮倒进研钵中，用研杵在超低温下将膝关节软骨持续研磨，小心收集研磨至粉末状软骨，提取其总蛋白，经处理后图像灰度值扫描，检测膝关节软骨组织中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA 的蛋白表达。

1.8 统计学方法采用 GraphPad Prism 8.3软件分析数据。计量资料多组间比较采用 One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用Dunnett检验，若数据方差不齐则采用Dunnett T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠软骨组织病理学评分比较由表1及图1可知，Model组组织病理学评分较Control组显著升高(P<0.05)，提示造模成功。DHJST组组织病理学评分较Model组明显下降(P<0.05)，提示独活寄生汤对KOA小鼠具有治疗作用。

表1 三组软骨组织病理学评分比较 (分)

图1 三组软骨病理组织学观察

2.2 三组小鼠软骨组织Zn2+荧光染色技术检测结果比较由图2可知，荧光检测结果显示，Model 组较Control 组软骨细胞内Zn2+含量明显增加，经独活寄生汤作用后，Zn2+含量大幅减少，提示独活寄生汤可明显降低Zn2+浓度。

图2 Zn2+荧光染色技术检测结果

2.3 三组小鼠软骨组织 RT-qPCR mRNA 表达比较表2显示，与Control组相比，Model组软骨组织中ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表达增加(P<0.05)，ZIP8 mRNA表达降低(P<0.05)；与Model组相比，DHJST组软骨组织中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表达降低(P<0.05)。

表2 各组小鼠软骨组织 RT-qPCR mRNA 相对表达量

2.4 Western blotting蛋白含量比较表3显示，与Control 组相比，Model组软骨组织中 ZIP8、MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表达增加(P<0.05)，ZNT9蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与 Model 组相比，DHJST 组软骨组织中 MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表达降低(P<0.05)，ZIP8、ZNT9蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 Western blotting 蛋白相对表达量

3 讨论

KOA病理特点为关节软骨损伤退变[10]，研究结果中，Model组小鼠膝关节病理观察可见，关节软骨层厚薄不一，关节软骨严重缺损、潮线不完整，大量纤维增生，说明对Model 组小鼠进行DMM后，关节软骨受损，符合早中期膝骨关节炎的病理表现，DHJST组小鼠膝关节病理表现可见，软骨层厚薄不一，关节软骨表层缺损，潮线较整齐，本研究结果中，独活寄生汤组小鼠软骨退变程度较Model组减轻，表明独活寄生汤具有保护KOA模型小鼠软骨的作用，这与既往研究结果一致[11～13]。

Zn2+在膝骨关节炎疾病中起免疫系统，炎症和新陈代谢的作用[14]。Zn2+是组成 MMPs 的重要成分，Zn2+是催化 MMP13 活性所必需的金属离子，同时也是 MMPs 的活化中心[15，16]。 Zn2+与 KOA 发病机理的联系在其作为基质降解酶的结构成分中得到了广泛认可。Zn2+在影响骨关节炎疾病时，受 ZIP 和 ZNT 家族的锌转运蛋白的控制[17，18]，在人类和小鼠的基因组中，编码了14个ZIP 和9个 ZNT 转运蛋白[19]。膝关节软骨中的Zn2+转运蛋白ZIP8 蛋白在受到外力创伤、炎症因子、异常机械压力等因素的刺激后[4]，其表达水平会异常增高，此时 ZIP8 蛋白会将细胞外的 Zn2+大量转运到细胞内，Zn2+的涌入会大量激活 MTF1，MMPs和聚蛋白样金属蛋白酶会被活化的 MTF1所激活[20]，最终破坏关节软骨。Song等[21]研究证实miR-488通过抑制ZIP8，进而减少Zn2+涌入细胞内，恢复了II型胶原蛋白的表达水平，减少了MMP-13被激活量，从而保护膝关节软骨。研究中，Model 组小鼠膝关节软骨细胞内Zn2+含量明显增加，说明造模成功后，Zn2+在细胞内大量增加，并参与到膝骨关节炎的发生过程，而经独活寄生汤作用后，软骨细胞内Zn2+含量大幅减少，提示独活寄生汤可抑制Zn2+，随着 Zn2+的减少，MTF1 表达降低，进而降低MMP3、MMP13表达，减少 MMPs 的被激活量，从而治疗KOA，这与前期独活寄生汤体外实验研究结果相一致。

锌离子转运蛋白ZIP 蛋白和 ZNT蛋白在调节细胞中的Zn2+中发挥重要作用。ZIP 转运蛋白将Zn2+从细胞外液或细胞内囊泡传递到细胞质中，而 ZNT 转运蛋白则促进Zn2+向细胞外空间移动或将细胞质锌螯合进入细胞内区室，本研究结果显示，与 Model 组相比，DHJST 组小鼠膝关节软骨组织中ZNT9 mRNA表达明显降低，ZIP8的相对表达量降低显著。独活寄生汤对Zn2+转运蛋白 ZIP8、ZNT9没有明显抑制或促进作用，这说明对Zn2+浓度有降低作用，但独活寄生汤对Zn2+进出软骨细胞的关键环节并没有明显影响。