拉萨裂腹鱼鱼卵振动敏感性及其适宜孵化模式

曾本和，刘海平，旺 久，牟振波，王万良，王金林，周建设，朱成科，杨瑞斌

( 1.西藏自治区农牧科学院 水产科学研究所，西藏 拉萨 850002； 2.西南大学荣昌校区 水产系，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，水产科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460； 3.华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070 )

拉萨裂腹鱼(Schizothoraxwaltoni)俗称拉萨弓鱼、贝氏裂腹鱼、尖嘴鱼，属鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，仅分布于西藏地区雅鲁藏布江中上游干、支流及附属水体，资源量少，生长速度缓慢，性成熟年龄较迟，为我国的特有种，也是西藏地区主要的经济鱼类之一[1]。受传统和宗教的影响，藏民不食鱼，目前拉萨裂腹鱼还有一定数量种群。然而，自20世纪50年代以来，大量外来人口入藏开发，捕鱼强度不断增强，尤其是近年来，随着人们生活水平的提高，吃“高原鱼”在很多地方成了一种时尚；拉萨裂腹鱼的需求量快速增长，捕捞量不断加大，已远超种群的增长速度[2]。另外，许多入侵种在雅鲁藏布江中已经形成了自然种群[3]，与土著鱼类竞争食物和生态位，也造成目前拉萨裂腹鱼的种群数量锐减。因此，研究及保护拉萨裂腹鱼资源迫在眉睫。然而目前有关拉萨裂腹鱼的研究较少，仅见分类[4-5]、起源和演化[4,6]方面的资料。随着西藏地区的经济发展，对拉萨裂腹鱼的研究开始增多，但也仅集中在分子系统发育与生物地理学[7-8]、年龄与生长[9]、食性组成[10]和人工驯养[11-13]方面，未见其受精卵孵化及敏感期的报道，不利于其种群资源的保护和合理利用。

开展拉萨裂腹鱼的人工繁育技术研究是其资源保护及合理利用的一项重要举措。自2010年以来，西藏相关单位便开展了拉萨裂腹鱼的繁育工作[14]，但还有许多基础研究尚未开展。目前拉萨裂腹鱼受精卵孵化一般采用水泥池+孵化框的原始孵化方法，水霉严重，挑取死卵耗费大量人力，苗种生产能力弱，严重阻碍了拉萨裂腹鱼规模化生产。同时，在以往的繁殖生产中还发现，拉萨裂腹鱼受精卵存在对水流敏感的现象，但目前尚未见拉萨裂腹鱼受精卵水流敏感期的相关研究。笔者以同一批繁殖的受精卵为试验对象，选择受精卵质量较好、一般、较差的3尾鱼受精卵，平列槽孵化方式受精率分别为91.23%、64.26%和45.65%(以下记为受精率91.23%、64.26%和45.65%受精卵)，用于孵化模式试验，平均分为3份，于平列槽、立式孵化器、圆柱形孵化器3种孵化器(非黏性、沉性卵常见的孵化模式)中孵化，每日对受精卵拍照，通过照片计算死卵数，直至出膜，统计孵化率；另选1尾鱼的受精卵(受精率88.54%)发育至不同时期时用不同频率振荡5 min，探索拉萨裂腹鱼适宜孵化模式以及振动对其孵化的影响；笔者旨在为选择及优选孵化方式和规模生产提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年5月，拉萨裂腹鱼受精卵取自西藏自治区拉萨市曲水县西藏土著鱼类增殖育种场(冷水性鱼卵、沉性卵、非黏性卵)，受精率分别为91.32%、64.26%和45.66%；用于振荡试验的受精卵受精率为88.54%。

1.2 方法

1.2.1 鱼卵孵化模式试验

将受精率91.23%、64.26%和45.65%的受精卵(2.5、2.7、2.8万粒)分别平均分为3份(体积法)，于平列槽、立式孵化器及圆柱形孵化器中孵化。孵化用水为曝气后的井水，水温(13.3±0.5) ℃，溶解氧8.5～9.9 mg/L。

平列槽：规格2.7 m×0.5 m×0.25 m，孵化盘规格49 cm×35 cm×3.5 cm，一端进水，另一端排水。水体交换频率每6～8 min交换1次。孵化盘中微流水，水流速率为(0.013±0.001) m/s。3尾鱼受精卵孵化密度分别为4.85、5.25、5.44粒/cm2。每日捡出死卵，并记录。

立式孵化器：0.8 m×0.8 m×1.0 m，分为8层，每层孵化盘规格为35 cm×30 cm×1 cm，水从最上层流入，最下层流出，每2 min交换1次。孵化盘中微流水，水流速率为(0.018±0.006) m/s。3尾鱼受精卵孵化密度分别为7.94、8.57、8.89粒/cm2。每日拍照，通过照片统计受精卵死亡率。

圆柱形孵化器：直径25 cm，高度60 cm，底部为倒放的圆锥形，水从下端进，最上端出，每1 min交换1次，水流速率为(0.385±0.177) m/s。每日拍照，通过照片统计每日受精卵死亡率。圆柱形孵化器孵化受精卵2次，第1次5月2日卵，进水口水流速率过大，第5天受精卵全部死亡；第2次5月22日卵，水流速率调节至(0.385±0.177) m/s时，能使受精卵刚飘浮起来，不会重叠，结果有部分鱼苗出膜；因此选择第2次孵化数据。

1.2.2 振荡对受精卵死亡率影响试验

选取同一尾鱼的受精卵(受精率88.54%)3.2万粒，于平列槽中孵化，孵化盘规格为49 cm×35 cm×3.5 cm，孵化密度为18.66粒/cm2，由受精到出膜，每一个发育时期随机捞取受精卵540粒，平均分为6个试验组，每组3个平行，每个平行30粒卵，于水浴恒温振荡器(SHZ-A)中，水温13 ℃，振动频率分别为0、50、100、150、200、250 r/min(换算为水流速率分别为0、0.157、0.314、0.471、0.628、0.785 m/s)，振荡5 min后转移到平列槽20 cm×20 cm的孵化盘中继续孵化，直到发育到下一个时期，统计受精卵或胚胎死亡数。

1.3 计算公式

R1=n1/n×100%

R2=n2/n×100%

R3=n3/n×100%

式中，R1为受精率(%)，R2为死亡率(%)，R3为孵化率(%)，n为总卵数，n1为平列槽孵化方式受精卵原肠中期时活卵数，n2为死卵数，n3为出膜仔鱼数。

1.4 统计方法

试验结果采用Excel 2010进行数据录入和初步统计；采用SPSS 19.0统计软件进行单因子方差分析，若差异显著，则进行Duncan′s多重比较，差异显著水平为0.05。

2 结 果

2.1 拉萨裂腹鱼受精卵在3种孵化器中的孵化率

3种孵化模式中拉萨裂腹鱼受精卵的孵化率见表1、图1。3种孵化器中，平列槽孵化率最高，91.23%、64.26%、45.66%的3种受精率受精卵的孵化率分别为81.74%、40.30%、6.08%；其次为立式孵化器，3种受精率受精卵的孵化率分别为32.77%、2.59%、0；圆柱形孵化器孵化率最低，3种受精率受精卵的孵化率分别为5.42%、0、0。平列槽孵化模式下，受精率91.23%的受精卵死亡主要集中在第1、2、11天，占总死亡数74.64%；受精率为64.26%和45.66%的受精卵，死亡主要集中在第1～5天、第9～11天，分别占总死亡数的96.52%和93.51%。立式孵化器模式下，受精率为91.23%的受精卵死亡主要集中在第1、2、7～11天，占总死亡数的90.95%；受精率为64.26%的受精卵，死亡主要集中在第1、2、6～11天，占总死亡数的95.20%；受精率为45.66%的受精卵，死亡集中在前7 d，第7天受精卵全部死亡。圆柱形孵化器孵化模式下，受精率91.23%的受精卵每日死亡数均较多；受精率为64.26%的受精卵死亡主要集中在第1～3天，占总死亡数89.11%，孵化第5天后受精卵全部死亡；受精率为45.66%的受精卵死亡主要集中在第1～3天，占总死亡数96.81%，孵化第4天后受精卵全部死亡。

表1 3种孵化模式下拉萨裂腹鱼受精卵孵化率 %Tab.1 Hatching rates of fertilized eggs of S. waltoni under three incubation modes

图1 不同孵化模式下拉萨裂腹鱼不同受精率受精卵累积死亡率Fig.1 Cumulative mortality of eggs with different fertilization rates in S. waltoni under different hatching modesa.受精率91.23%受精卵; b.受精率64.26%受精卵; c.受精率45.66%受精卵.a.fertilized egg with 91.23% fertilization rate; b.fertilized egg with 64.28% fertilization rate; c.fertilized egg with 45.66% fertilization rate.

2.2 不同流速对不同发育时期拉萨裂腹鱼胚胎死亡率的影响

不同流速对拉萨裂腹鱼不同发育期胚胎死亡率的影响见表2、表3。流速为0时，受精卵死亡率最低[(0.22±0.15)%]，与流速为0.157～0.471 m/s组间差异不显著(P>0.05)，显著低于0.628～0.785 m/s组(P<0.05)；流速为0.157～0.628 m/s组受精卵死亡率组间差异不显著(P>0.05)；流速0.785 m/s组死亡率最高，显著高于其他试验组(P<0.05)。流速0～0.471 m/s条件下发育时期对受精卵死亡率影响见表4。原肠晚期死亡率最高，为(10.00±5.61)%，显著高于其他试验组(P<0.05)；其次是多细胞期，为(5.83±2.85)%，与原肠中期、64细胞期、尾芽出现期、神经胚期、尾泡出现期、眼晶出现期、耳囊出现期、32细胞期差异不显著(P>0.05)，显著高于其他各发育时期(P<0.05)。流速0.157～0.628 m/s条件下发育时期对受精卵死亡率影响见表5。64细胞期死亡率最高，为(26.67±23.45)%，与原肠晚期、多细胞期差异不显著(P>0.05)，显著高于其他各发育时期(P<0.05)。流速0.785 m/s条件下心脏原基期及心脏搏动期死亡率最低，为0，其他各发育时期均较高。4细胞期、8细胞期、64细胞期、多细胞期、囊胚晚期死亡率超过90%，囊胚早期死亡率超过80%，16细胞期死亡率超过70%，胚盘期、2细胞期、32细胞期、高囊胚期、囊胚中期死亡率超过60%，尾芽出现期、耳石期死亡率超过50%。

表2 不同流速下拉萨裂腹鱼胚胎各发育时期死亡率 %Tab.2 Mortality of embryos of S. waltoni at different developmental stages at different flowing rates

表3 流速对拉萨裂腹鱼胚胎死亡率的影响Tab.3 Effect of flowing rate on mortality of embryos of S. waltoni

3 讨 论

3.1 流速对拉萨裂腹鱼受精卵孵化的影响

水温[15]、光照[16]、盐度[17]、溶解氧[18]、水流速率[18]等诸多因素均会影响鱼卵孵化。已有的研究表明，七彩鲑(Salvelinusfontinalis)[19]、细鳞鱼(Brachymystaxlenok)[20]、大银鱼(Protosalanxhyalocranius)[21]、金鳟(Oncorhynchusmykiss)、虹鳟(O.mykiss)[22]鱼卵在不同的发育期对振动均有不同程度的敏感。本试验中，流速≤0.471 m/s时，各发育时期受精卵死亡率均较低，且差异不显著；流速≥0.628 m/s时，受精卵死亡率显著升高。各流速下死亡率较高的发育时期有：64细胞期、多细胞期、囊胚晚期、原肠晚期、尾芽出现期及耳石期。在自然界中，拉萨裂腹鱼选择水流相对平缓或静水流域产卵孵化，卵产出受精后吸水膨胀，沉落于鹅卵石缝中发育孵化[23]，拉萨裂腹鱼受精卵具有振动敏感期，不在急流水域中产卵孵化是鱼类长期生活对环境的适应。本试验初步确定，拉萨裂腹鱼受精卵具有振动敏感期，但具体原因尚不清楚，有待进一步研究。建议选择平列槽等静水装置对鱼卵进行孵化，同时尽量在对水流敏感性相对较弱的时期神经胚期—尾泡出现期(13 ℃，第4天)及心脏原基—心脏搏动期(13 ℃，第6～9天)进行消毒、挑卵或者短途运输等工作。

3.2 3种模式孵化拉萨裂腹鱼受精卵的比较

目前冷水性、沉性、非黏性卵常见的孵化方法有水泥池+孵化框、平列槽+孵化框、立式孵化器、圆柱形孵化器。本试验结果表明，拉萨裂腹鱼受精卵在平列槽中孵化效果最好，立式孵化器次之，圆柱形孵化器最差。平列槽水流速率0.013 m/s，受精卵基本不受流速影响，同时每日挑取死卵，防止水霉感染，因此孵化率最高；但人工挑取死卵耗费大量的人力和财力，同时，平列槽孵化方式占地面积大。立式孵化器占地空间小，可批量孵化鱼苗；在孵化前期立式孵化器受精卵死卵率和平列槽差异不大，第5～7天开始暴发水霉，受精卵开始大量死亡；因此，采用立式孵化器孵化要研究防控水霉的方法。圆柱形孵化器占地空间小，水流使受精卵不会重叠，因此无水霉感染；但圆柱形孵化器受精卵在前3 d大量死亡。拉萨裂腹鱼产卵场一般在浅水中，底质多是鹅卵石，淤泥较少，且河流的周围多是鹅卵石和石块，表层水流速率0.2 m/s[23]，卵产出受精后吸水膨胀，沉落于鹅卵石缝中发育孵化，石缝中水流速率更低。圆柱形孵化器进水口平均水流速率0.385 m/s，水流速率高对受精卵刺激很大，而拉萨裂腹鱼受精卵在前3 d的多细胞期、囊胚早期、囊胚晚期、原肠中期时对水流均非常敏感，导致受精卵在前3 d大量死亡。因此圆柱形孵化器需要调控进水口水流速率和方向，降低对受精卵的冲击力度，使受精卵能正常孵化。

4 结 论

拉萨裂腹鱼不同发育时期受精卵对水流有不同程度的敏感性。各流速下死卵率均较高的发育时期有：64细胞期、多细胞期、囊胚晚期、原肠晚期、尾芽出现期及耳石期，对水流敏感性最弱的时期有：神经胚期—尾泡出现期(13 ℃，第4天)及心脏原基—心脏搏动期(13 ℃，第6～9天)。因此，建议采用水流速率较小的孵化设施对其受精卵进行孵化，同时在其对水流敏感性最弱的时期(神经胚期—尾泡出现期及心脏原基—心脏搏动期)进行消毒、挑卵或者短途运输等工作。