尼罗罗非鱼CD2-like基因克隆及其胞外区表达研究

陈福暖，高晓琳，曾晓怜，谢彩霞，汪志文,2，鲁义善,2，吴灶和，王忠良,2，王 蓓,2

( 1.广东海洋大学 水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088； 2.广东海洋大学 深圳研究院，广东 深圳 518000 )

白细胞分化抗原2(CD2)是T淋巴细胞上一类重要的黏附分子，它通过与胸腺基质细胞、红细胞、巨噬细胞等细胞表面CD2配体结合，在T淋巴细胞发育成熟及活化中发挥着重要的作用[1]。细胞表面特异性黏附分子的表达，使多细胞生物的许多细胞选择性地附着于自身类型的细胞上[2]。这种具有选择性的细胞黏附或细胞分选在细胞调控形态和信号转导方面起着重要作用。在大鼠中CD48为CD2的主要结合配体，而在人类中CD2的主要结合配体则是具有高亲和力的CD58。CD2与配体分子的相结合，对大多数T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞发育成熟及活化表现出一定的共刺激作用[3-5]。近年来CD2分子、CD2配体以及它们形成的复合物结构性质的解析研究取得了很大的进展，进一步丰富了哺乳动物中CD2分子的功能研究[6-7]；但关于鱼类CD2基因的相关信息却少有报道。

目前，罗非鱼是世界上养殖最普遍的鱼类之一，也是我国淡水养殖的主要品种，在全国淡水养殖鱼类产品产量中排名第6位[8]。引起罗非鱼病害的根本原因是养殖环境的恶化和养殖鱼类抗病力的下降[9]。对此，可以通过测定酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性来初步判断鱼类免疫力的高低，进而选择最佳的养殖环境[10]。尽管目前已有研究表明，硬骨鱼类拥有T淋巴细胞介导的细胞免疫应答，CD3不同肽链的cDNA序列以及CD4、CD8分子的cDNA序列已相继被证明在多种鱼类中存在[11]，但鱼类的免疫系统研究依旧处于起步阶段，而对鱼类CD2表达谱和功能特性的研究相对较少，甘桢等[12]研究发现，CD2胞质结合蛋白2(CD2BP2)基因全长1429 bp，并具有头肾、脾脏等免疫组织高表达特征。因此，笔者旨在通过克隆鉴定尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)中与CD2具有相似结构的CD2-like基因和探究其胞外区原核表达情况，优化表达条件，以及在变性条件下，复性纯化出相关功能蛋白，为进一步研究CD2-like在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

试验用健康尼罗罗非鱼，体质量(150±50) g，购于高州朗业畜牲渔业科技养殖有限公司，且于广东海洋大学水产学院东海岛海洋生物基地暂养4周。

1.1.2 质粒

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(大连)，原核表达载体pGEX-6P-1由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存。

1.1.3 主要试剂

总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Ex Taq DNA聚合酶、T4连接酶、EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒购自Thermo公司，琼脂糖、尿素、二硫苏糖醇、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、感受态大肠杆菌(Escherichiacoil) DH5α以及BL21菌株由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 尼罗罗非鱼总RNA的提取及cDNA的合成

尼罗罗非鱼于(25±2) ℃暂养4周后，在无菌操作台上取健康尼罗罗非鱼头肾组织15～20 mg，按照北京全式金TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒的说明方法提取总RNA后。将提取的上述组织按照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明方法反转录合成cDNA第一链。

1.2.2 CD2-like基因的克隆

根据数据库中罗非鱼CD2-like基因(GenBank登录号：XM_005460661.4)片段序列，利用Primer Premier 5.0设计罗非鱼CD2-like基因的ORF引物On-CD2L-1F和On-CD2L-1110R9(表1)。以罗非鱼头肾组织cDNA第一链为模板进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃，10 min[10-13]。然后进行PCR产物电泳检测、目的条带纯化回收、与pMD 18-T Vector连接、连接产物转化步骤后，挑选克隆用菌落PCR鉴定，并将挑选的阳性克隆样本送至广州生物工程有限公司测序。

表1 试验所用引物Tab.1 PCR primers used in this experiment

1.2.3 CD2-like胞外区基因的克隆

与测序结果比对无误后，根据罗非鱼CD2-like基因胞外区片段(G88～A645)设计原核表达引物：On-6P1-CD2L-88F和On-6P1-CD2L-645F。以pMD18T-CD2L为模板进行 PCR 扩增，扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃，10 min[10-13]。然后进行PCR产物电泳检测、目的条带纯化回收、与pMD 18-T Vector连接、连接产物转化步骤后，挑选克隆用菌落PCR鉴定，并将挑选的阳性克隆样本送至广州生物工程有限公司测序。

1.2.4 CD2-like基因序列的分析

将挑选的阳性克隆的测序结果用DNAMAN Version 6 软件进行拼接，以获得OnCD2-like编码序列。OnCD2-like序列比对分析：美国国立生物技术信息中心 (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)；氨基酸序列推导、开放阅读框确定、理论等电点预测、分子量和亲水性参数的分析推导：ORF Finder (http:∥www.ncbi.nim.nih.gov/govf/govf.html)和ExPASy Proteomics Server (http:∥ca.expasy.org)；信号肽序列预测：SignalP 4.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/signalp)；跨膜结构域预测：TMHMM Server2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)；氨基酸基本功能位点分布预测：SoftBerry-Psite (http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc Inter Proscan)；蛋白功能结构域分析：Inter ProScan Sequencesearch (http:∥www.ebi.ac.uk/Tools)；二级结构、三维结构预测分析：SOPMA (https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISSM-MODEL (http:∥swissmodel.expasy.org/inter active)；邻接法构建系统进化树：Clustal X 和MEGA 6.0 软件，利用MEGA 6.0 采用邻位相连法构建CD2-like系统进化树。

1.2.5 原核表达载体的构建

提取测序正确的重组质粒和pGEX-6P-1表达质粒，经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切后，用T4连接酶和CD2-like胞外区片段的酶切产物连接，而后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,并于摇床上以37 ℃、200 r/min条件培养1 h。用含有Amp+的LB平板筛选结合菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定，将阳性克隆重组质粒送广州生物工程有限公司测序。

1.2.6 诱导表达重组蛋白

将测序正确的重组质粒命名为pGEX-6P1-CD2L，并将含有表达载体的大肠杆菌BL21以1∶100数量比例接种于Amp+的LB液体培养基中，在37 ℃的摇床200 r/min 扩大培养至600 nm光密度值(D600)达0.4～0.6时加入IPTG，使其终浓度为1 mmol/L，继续培养6 h。菌体预处理后进行超声破碎获取全菌蛋白，程序设置为：200 W条件下破碎4 s，间隔6 s，破碎时间为10 min。直至菌液变清，离心，收集上清液和沉淀后经SDS-PAGE 分析。

1.2.7 重组蛋白表达的条件优化

(1)IPTG浓度：在确定温度为37 ℃，诱导时间为6 h的条件下，设置IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L，收集菌体，用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。采用解离非连续缓冲系统垂直板电泳。丙烯酰胺体积分数：分离胶10%，浓缩胶5%。每孔上样10 μL，浓缩胶以80 V电压通电30 min，分离胶以120 V电压通电1 h，染色，脱色。

(2)时间：在确定温度为37 ℃，IPTG诱导浓度为0.2 mmol/L的条件下，诱导2、4、6、8、10 h分别收集菌体，用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。

(3)温度：IPTG浓度为1.0 mmol/L，在18、28、37 ℃条件下诱导6 h，离心后置于冰上进行超声破碎，程序设置为：200 W条件下破碎4 s，间隔6 s，破碎时间为10 min，直至菌液变清，离心，收集上清液和沉淀，以SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量。

1.2.8 变性条件下重组蛋白的表达、复性以及纯化

根据重组蛋白表达的条件优化结果，利用含有Amp+的500 mL 营养肉汤液体培养基对活化后的目的菌种进行大量原核表达，将经原核表达的菌种分次加入50 mL离心管，离心收集菌体。

(1)目的菌体的收集：收集好细菌沉淀后，每克细菌沉淀湿质量加入2～5 mL的破碎缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0内含150 mmol/L氯化钠、1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，并加入500 mmol/L溶菌酶至终质量浓度为1 mg/mL，混匀，冰浴30 min。随后冰上进行超声破碎，200 W条件下超声6 s、间隔 8 s，至悬液半透明。

(2)包涵体收集清洗：于4000 r/min转速下4 ℃离心50 min，弃上清液，用破碎缓冲溶液重悬沉淀并将悬液再次于4000 r/min转速下4 ℃离心50 min，弃上清液后往沉淀中加入洗涤液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，内含2 mol/L尿素、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5% Triton X-100、0.1 mol/L氯化钠以及10 mmol/L二硫苏糖醇)，4000 r/min，4 ℃离心10 min后收集沉淀。

(3)包涵体的稀释复性：将洗涤后的包涵体沉淀，加入变性液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，含8 mol/L尿素、20 mmol/L二硫苏糖醇)进行过夜变性溶解；次日，将溶解后的包涵体溶液加入复性液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L氯化钠、5%甘油、1 mmol/L二硫苏糖醇)并按照2倍体积倍比进行梯度稀释复性，直至稀释到尿素终浓度达到 0.5 mol/L；最后利用截留分子质量为10 ku的超滤浓缩管浓缩复性后的溶液。

(4)复性后包涵体的纯化：此后与以8∶1体积比例的谷胱甘肽琼脂糖树脂匀浆混合，4 ℃旋转30 min，于4000 r/min离心5 min后弃上清液。沉淀加入10倍于柱床体积的漂洗液(Tris-HCl pH 8.0)反复颠倒混匀以洗去未与谷胱甘肽琼脂糖树脂结合的杂蛋白，于离心机4 ℃，500 r/min离心5 min后弃上清液，重复3次；加入等柱床体积的洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，内含10 mmol/L谷胱甘肽)重悬树脂，室温孵育10 min 后于4000 r/min离心5 min保留上清液；再用等体积的洗脱缓冲液洗脱并离心后合并2次所得上清液，即为纯化得到的谷胱甘肽(GST)融合蛋白；取40 μL该蛋白溶液与6×Loading buffer，以体积比1∶5混匀，煮沸5 min后离心收集上清液，进行SDS-PAGE，观察蛋白纯化情况。

2 结果与分析

2.1 尼罗罗非鱼CD2-like基因的克隆及理化性质

克隆获得尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物，并命名为OnCD2-like(GenBank登录号为：MN296489)，开放阅读框为1110 bp，其中胞外区长558 bp，可编码369个氨基酸(图1)。理论分子质量41.53 ku，理论等电点(PI)为9.76。使用Signal P 4.1 Server 预测该序列的信号肽，发现前29个氨基酸为信号肽序列；利用TMHMM Server v. 2.0在线网站预测发现，OnCD2-like蛋白的第1～215位氨基酸位于细胞外，第242～369位氨基酸位于细胞内，而216～241位氨基酸为跨膜结构域(图2)。SoftBerry-Psite预测该序列功能位点，发现该序列N-糖基化位点有3个，腺苷一磷酸和环磷鸟嘌呤核苷依赖性蛋白激酶磷酸化位点3个，蛋白激酶C磷酸化位点有9个，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个，N-豆蔻酰化位点2个，原生质膜脂筏附着位点2个，CAAX box 3个，C末端定位信号序列微体4个。

图1 OnCD2-like基因序列及其推导氨基酸序列Fig.1 Sequence and deduced amino acid sequence of OnCD2-like gene“”表示信号肽； “----”表示免疫球蛋白样结构域(38～101)； “”表示免疫球蛋白样结构域(126～197)； “”表示富含脯氨酸结构域(230～369).“”stands for signal peptide; “----” stands for immunoglobulin-like domain (38—101); “” stands for immunoglobulin-like domain (126—197); “” stands for proline-rich domain (230—369).

图2 OnCD2-like跨膜结构域的预测Fig.2 Predicted transmembrane domain of CD2-like protein in tilapia

ProtParam在线分析结果显示，推测赖氨酸(Lys)占比为8.7%；谷氨酰胺(Gln)为8.1%；蛋氨酸(Met)为0.8%。其中带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)有55个，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)有31个。不稳定指数为44.60，归类为不稳定蛋白。该蛋白脂溶指数为66.83，总平均亲水值为-0.799，很有可能是亲水蛋白。ProtScale分析表明，OnCD2-like蛋白亲水性氨基酸占比较高，亲水区域较大，为亲水性蛋白，与理化分析的结果一致。因此推测On-CD2-like基因编码的蛋白质为亲水性蛋白。

2.2 OnCD2-like二级结构和三级结构预测

通过SOPMA分析OnCD2-like的二级结构(图3)，发现该蛋白二级结构中存在：由56个氨基酸组成的α螺旋，占15.18%；由15个氨基酸组成的β转角，占4.07%；由85个氨基酸组成的延伸链，占23.01%；由213个氨基酸组成的无规则卷曲结构，占57.72%。利用SWISS-MODLE在线预测蛋白质三级结构工具分析发现，OnCD2-like属于免疫折叠蛋白，能够与人类CD2分子高度重合，表明OnCD2-like与人类CD2分子结构具有一定相似性(图4)。

图3 OnCD2-like二级结构预测Fig.3 The prediction of secondary structure of OnCD2-like

图4 OnCD2-like蛋白与人类CD2蛋白三维结构Fig.4 The three-dimensional structures of CD2-like protein in tilapia and CD2 in Homo sapiens

2.3 OnCD2-like系统进化分析

本研究基于OnCD2-like氨基酸序列以及斑马拟丽鱼(Maylandiazebra)、多刺棘光鳃鲷(Acanthochromispolyacanthus)、眼斑双锯鱼(Amphiprionocellaris)、高山倭蛙(Nanoranaparkeri)、原鸡(Gallusgallus)、家鼠(Musmusculus)、家牛(Bostaurus)和人(Homosapiens)等的相关数据，在MEGA 6.0软件中采用邻接方法构建系统进化树。分析该进化树发现，尼罗罗非鱼和同属鲈形目慈鲷科的斑马鱼亲缘关系最为相近，且聚为一支；其次与同属鲈形目的泰国斗鱼(Bettasplendens)亲缘关系也较相近，与其他哺乳动物亲缘关系则相对较远(图5)。

图5 OnCD2-like氨基酸序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of CD2-like amino acid sequence of tilapia

2.4 OnCD2-like胞外区原核表达

根据OnCD2-like基因设计引物，克隆获取该基因胞外段(G88～A645)，并成功构建pGEX-6P1-CD2L原核表达载体。原核表达结果显示，未诱导的菌株前后均未出现目的蛋白，重组蛋白主要在包涵体中表达(图6a)，pGEX-6P1-CD2L融合蛋白分子质量约为46 ku，OnCD2-like胞外区片段蛋白分子质量约为20 ku。随后原核表达条件摸索试验结果显示，浓度为0.2 mmol/L的IPTG即可诱导目的蛋白高效表达(图6b)；2～10 h目的蛋白的表达量增加，6 h后表达量增加不明显(图6c)；重组蛋白GST-CD2-like融合蛋白在18、28、37 ℃的包涵体蛋白中均有表达，在37 ℃条件下蛋白表达量较高(图6d)。

图6 GST-CD2-like融合蛋白表达及其条件优化SDS-PAGE分析Fig.6 Expression protein and SDS-PAGE analysis of optimized conditions in GST-CD2-like fusiona：M.全式金蛋白分子标准； 1.未经IPTG诱导的全菌蛋白； 2.经IPTG诱导的全菌蛋白； 3、4.经IPTG诱导的上清液、沉淀重组蛋白表达. b：M.全式金蛋白质分子标准； 1.未经IPTG诱导的全菌蛋白； 2～6. IPTG诱导浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L 诱导后的全菌蛋白. c：M.赛默飞世尔蛋白质分子标准； 1.未诱导的全菌蛋白； 2～6.全菌蛋白诱导时间分别为2、4、6、8、10 h. d：M.全式金蛋白质分子标准； 1～2.对照组未诱导及18 ℃诱导； 3～4.对照组未诱导及28 ℃诱导； 5～6.对照组未诱导及全菌蛋白.a: M.Trans protein molecular marker; 1.whole bacterial protein without IPTG inducing; 2.whole bacterial proteinr with IPTG inducing; 3,4.supernatant and precipitated recombinant protein expression with IPTG inducing. b: M.Trans protein molecular marker; 1.whole bacterial protein without IPTG inducing; 2—6.total protein of recombinant bacteria induced by 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, and 1.6 mmol/L IPTG. c: M.Thermo Fisher protein molecular marker; 1.the recombinant bacteria without IPTG inducing; 2—6.total protein of recombinant bacteria inducing at 2, 4, 6, 8 and 10 h, respectively. d: M.Trans protein molecular marker; 1—2.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein induced at 18 ℃; 3—4.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein induced at 28 ℃; 5—6.the recombinant bacteria without IPTG inducing and inclusion body protein.

2.5 包涵体中GST-CD2-like融合蛋白的变性、复性与纯化

在包涵体蛋白复性纯化过程中分别选取经洗涤液洗涤后、复性后和纯化洗脱后3个不同阶段的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(图7)。结果显示，CD2-like融合蛋白表达含量高(图7泳道1)；当蛋白溶液被复性液等浓度梯度稀释至尿素终浓度为0.5 mol/L(即相当于稀释16倍)时，GST-CD2-like融合蛋白仍然保持可溶，尽管复性后蛋白存在部分降解，但依旧有相当一部分结构完整的GST-CD2-like融合蛋白保留(图7泳道2)；将复性浓缩后的融合蛋白利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进行亲和层析纯化，润洗去除杂蛋白后最终用10 mmol/L还原型谷胱甘肽溶液进行目标蛋白的洗脱，得到目的融合蛋白(图7泳道3)，并且将洗脱液洗脱后的融合蛋白与标签蛋白进行SDS-PAGE电泳(图8)。综上所述，本研究成功地在变性条件下，通过纯化复性获取了目的蛋白。

图7 GST-CD2-like融合蛋白变性、复性与纯化等产物SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE of denaturation, renaturation and purification of GST-CD2-like recombinant protein M.蛋白质分子标准； 1. 2 mol/L 尿素溶解后包涵体全菌蛋白； 2.梯度稀释复性后经10 ku浓缩管浓缩后的全菌蛋白； 3.谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化后的GST-CD2-like融合蛋白.M.protein molecular marker; 1.inclusion body whole bacterial protein after 2 mol/L urea dissolution; 2.whole-bacterial protein after concentration and renaturation in a 10 ku concentrating tube; 3.GST-CD2-like-I fusion protein by glutathione agarose resin purification.

图8 重组蛋白pGEX-6P1-CD2L SDS-PAGE分析Fig.8 Identification of GST-CD2-like recombinant proteins by SDS-PAGEM.蛋白质分子标准； 1.经IPTG诱导的GST标签蛋白； 2.纯化后的包涵体蛋白SDS-PAGE结果.M.protein molecular marker; 1.GST-tagged protein with IPTG inducing; 2.SDS-PAGE results of purified inclusion body protein.

3 讨 论

T淋巴细胞激活需要两组信号：一是通过T淋巴细胞上的T淋巴细胞抗原受体(TCRs)与抗原肽—主要组织相容性复合体(p-MHC)结合提供刺激信号；二是通过T淋巴细胞上的共刺激受体与抗原提呈细胞上的配体的相互作用提供信号。CD2是能够传递共刺激信号最具特征的受体之一，主要是在T淋巴细胞和自然杀伤细胞表面表达的一种细胞表面糖蛋白，在刺激T淋巴细胞的活化与细胞黏附方面起着重要作用[14-15]。近年来，相关研究表明，多种哺乳动物中存在CD2，其结构以免疫功能等的相关研究较多[16-18]；在哺乳动物中，CD2可以作为共刺激分子发挥作用，促进白细胞介素2(IL-2)的产生，IL-2是促进T淋巴细胞增殖分化的最重要的细胞因子；同时在自然杀伤细胞上的CD2也是介导效应靶结合形成的重要因子，并通过z链传递下游信号，引起细胞毒性颗粒的胞吐作用[19-21]。但迄今为止对于鱼类CD2的研究较少，目前在硬骨鱼类中CD2基因克隆鉴定研究仅见银鲫(Carassiusauratusgibelio)[22]、斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)[23]以及尼罗罗非鱼[24]等少数硬骨鱼，对鱼类CD2表达谱及功能特性的研究也相对有限。已有研究表明，CD2可能在尼罗罗非鱼细胞内细菌的免疫应答中发挥重要作用[24]。

3.1 OnCD2-like基因序列结构分析

依据预测序列，对尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物进行克隆鉴定，获得OnCD2-like基因全长为1110 bp，可以编码369个氨基酸。预测发现，该蛋白序列含有1个信号肽区域和2个免疫球蛋白样结构域。此外，通过SoftBerry-Psite在线预测，发现该分子胞外区还具有2个蛋白激酶C磷酸化位点(氨基酸位点:129～131，168～170)，这暗示着位于该蛋白胞外区具有完整的抗原结合位点，对于抗原信息传递具有重要作用。通过InterPro 在线软件分析OnCD2-like氨基酸序列中的保守结构域发现，胞质尾区富含脯氨酸结构域(230～369)，已有研究证明，该结构域在鼠与人之间有着显著的同源性，表现出较高的保守性[25]。综上所述，基于相关的保守结构域和位点较为保守推测，OnCD2-like蛋白功能保守。

3.2 OnCD2-like胞外区蛋白

原核表达结果显示，重组蛋白大部分以包涵体形式存在，并且在37 ℃下，0.2 mmol/L的IPTG诱导6 h时，包涵体蛋白表达量最高。在原核表达过程中，为求目的蛋白以高翻译率表达而进行高温、高诱导浓度诱导蛋白表达，但导致细菌蛋白质质量控制系统耗竭，引起部分折叠或错误折叠的蛋白分子聚集而形成包涵体[26]。包涵体蛋白是非正确折叠状态的聚集体，不具有生物学活性[27]。鉴于OnCD2-like胞外区蛋白多以包涵体形式存在，如果能成功对表达出的目标蛋白进行变性溶解和复性纯化，将有利于蛋白的纯化以及纯度的提高，从而为后续的蛋白功能研究奠定基础。因此，笔者决定在变性条件下对OnCD2-like胞外区包涵体蛋白进行纯化复性。

3.3 OnCD2-like胞外区蛋白梯度稀释复性

本研究中采用的包涵体复性方法为梯度稀释复性，梯度稀释的方法可以为蛋白提供充分的复性时间，促使蛋白质缓慢发生变化以适应外环境，这有利于蛋白与复性液充分结合，从而获取大量复性后的目的蛋白。透析复性也是包涵体复性常用的方法，然而相较于梯度稀释复性，透析复性可能会因缓冲液交换过程中尿素去除过快，导致蛋白大量析出而出现大量絮状沉淀，不利于后续的蛋白功能研究[28]。故此，通过比较上述两种方法，本研究中采用了梯度稀释复性方法进行。GST-CD2-like融合蛋白经梯度稀释复性后，得到目的蛋白条带单一，无杂蛋白条带存在，表明梯度复性纯化方法纯化了目标蛋白且高效可行。本研究在变性条件下探究了该OnCD2-like分子胞外区包涵体蛋白的纯化方法，这不仅为包涵体蛋白的纯化复性方法提供了参考，也为进一步研究尼罗罗非鱼CD2分子在先天免疫中的功能作用奠定了基础。

4 结 论

本研究成功克隆OnCD2-like基因，全长1110 bp，其中胞外区长558 bp，可编码369个氨基酸。生物信息学分析显示，OnCD2-like基因序列结构中含有信号肽区域1个、免疫球蛋白样结构域2个、跨膜结构区以及富含辅氨酸胞质尾区各1个；通过免疫球蛋白结构域及富含辅氨酸的胞质尾区所具有的结构证明，该分子具有较高的保守性。OnCD2-like系统进化树分析显示，尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼聚为一支；三级结构预测结果显示，OnCD2-like基因所编译的蛋白与人类CD2蛋白具有相似性。原核表达条件优化为：37 ℃条件下，0.2 mmol/L IPTG诱导6 h，依据最佳条件通过梯度稀释复性的方法成功纯化出OnCD2-like胞外区蛋白。