含氮杂环酸柏木酯合成与抑菌活性研究

孟斌斌，朱凯

(1.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037； 2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

杉木精油的主要成分为柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯等，通过结晶和重结晶,可得柏木醇等产品[1-4]。柏木醇为叔醇，空间位阻较大，虽可合成乙酸柏木酯、肉桂酸柏木酯和丙烯酸柏木酯等，但原料的位阻对叔醇酯化效率有明显的影响[5-9]。

含氮杂环化合物在生物的新陈代谢和生理活动过程中有着非常重要的调节作用[10]。喹啉、吡啶、吲哚、嘧啶等含氮杂环衍生物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫和消炎等多种生物活性，经常被设计建构在某些分子的结构上，赋予这些分子新的生物活性[11-14]。本文采用DCC/DMAP法催化酯化合成含氮杂环酸柏木酯，并对其抑菌活性进行研究。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

柏木醇(98%)，自制；琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二环己基碳二亚胺(DCC)、氘代二甲亚砜、喹哪啶酸、吲哚-3-羧酸、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、碳酸钠、石油醚、盐酸、氯化钠、无水硫酸钠、溴化钾、氢氧化钠均为分析纯；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由南京野生植物研究所提供；大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)由本校实验室提供。

YM系列不锈钢智能型立式压力蒸汽灭菌锅；ZHWY-2102C型双层小容量全温度恒温培养振荡器；SHP-250型生化培养箱；AVANCE III 600 MHz型超导核磁共振谱仪；VERTEX 80V型全数字红外光谱仪。

1.2 含氮杂环酸柏木酯合成

以柏木醇和含氮杂环酸为原料，通过DCC/DMAP催化酯化合成了含氮杂环酸柏木酯，合成路线如下：

1.2.1 喹哪啶酸柏木酯的合成与结构表征 取1 mmol 喹哪啶酸(0.176 7 g)与1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL二氯甲烷中，冰浴下搅拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)与0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，室温搅拌24 h，反应结束。过滤，旋蒸得到固体产物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h，过滤，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗涤，直至呈中性为止，再用饱和NaCl清洗，经无水硫酸钠干燥后减压蒸馏得到固体产物。粗品经柱层析纯化(石油醚与乙酸乙酯体积比为4∶1)，得到白色粉末状物质0.078 0 g，产率为21%。

1.2.2 吲哚-3-羧酸柏木酯的合成与结构表征 取1 mmol吲哚-3-羧酸(0.164 4 g)与1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL丙酮中，冰浴下搅拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)与0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，55 ℃下搅拌6 h。过滤，旋蒸得到固体产物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h。 过滤，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗涤，直至呈中性为止，再用饱和NaCl清洗，经无水硫酸钠干燥后减压蒸馏得到固体产物。粗品经柱层析纯化(石油醚与乙酸乙酯体积比为4∶1)，得到白色粉末状物质0.082 5 g，产率为23%。

1.3 抑菌活性研究

采用滤纸片法测定样品的抑菌圈，确定样品的抑菌活性。

1.3.1 液体LB培养基的配制 在950 mL的去离子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，以5 mol/L的NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1 L，在103.4 kPa(15 psi)高压下蒸汽灭菌20 min。

1.3.2 固体LB培养基的配制 在950 mL的去离子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，加热融化，以5 mol/L的NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1 L，在15 psi高压下蒸汽灭菌20 min。

1.3.3 菌种的活化 取0.1 mL菌液加入10 mL LB液体培养基中，在37 ℃培养8～10 h，待用。

东柳院村全年日照为2710小时，幅射能量132856千卡，得天独厚的自然能源为推进光伏扶贫创造了先决条件。武志锋抓住机遇，获得了光伏扶贫示范项目，总投资75万元，总发电100KW，2017年3月建成发电，14个月已发电18万度，创产值15.84万元。他给深度贫困户毎年每户发放3000元；给重度残疾人和80岁以上的老人毎年每户补贴1000元；给本村考入本科大学的学生当年奖励2000元、专科1000元。

1.3.4 滤纸片制备 选用吸水性强的优质滤纸，6 mm打孔机打下圆纸片，紫外灯下灭菌备用。

1.3.5 抑菌活性测定 无菌条件下，在直径90 mm的培养皿中，加入20 mL冷却到50 ℃的固体培养基(已加入1 mL活化后的菌液)，冷却至室温，将灭菌后的滤纸片沾取不同浓度的精油贴在营养平板上，滤纸间距离适中。同时，用丙酮作为对照。用封口膜将培养皿密封后，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，测定其抑菌圈直径。每组3次平行加空白对照实验，3次重复。

2 结果与讨论

2.1 对枯草芽孢杆菌的抑菌活性

柏木醇及含氮杂环酸柏木酯对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径见表1。

表1 不同样品对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径Table 1 Inhibition zone diameter of different samples against Bacillus subtilis

由表1可知，3种样品对枯草芽孢杆菌均有一定的抑制效果。其中喹哪啶酸和柏木醇浓度为2.5 mg/mL时就可达到对枯草芽孢杆菌的中度敏感。在浓度为5.0 mg/mL时，柏木醇、吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯的抑菌圈分别为12，11，13 mm，3种样品对枯草芽孢杆菌的抑制效果顺序为喹哪啶酸柏木酯>柏木醇>吲哚-3-羧酸柏木酯。

2.2 对金黄色葡萄球菌的抑菌活性

柏木醇及含氮杂环酸柏木酯对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表2。

表2 不同样品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径Table 2 Inhibition zone diameter of different samples against Staphylococcus aureus

由表2可知，3种样品对金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果，喹哪啶酸柏木酯的抑菌效果最好，浓度为5.0 mg/mL的条件下抑菌圈可达13 mm。 吲哚-3-羧酸柏木酯对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差，在1.3 mg/mL的浓度下无抑菌效果。

2.3 对大肠杆菌的抑菌活性

柏木醇及含氮杂环酸柏木酯对大肠杆菌的抑菌圈直径见表3。

表3 不同样品对大肠杆菌的抑菌圈直径Table 3 Inhibition zone diameter of different samples against Escherichia coli

由表3可知，不同样品对大肠杆菌均有一定的抑菌效果。柏木醇对大肠杆菌的抑制效果较差，在5.0 mg/mL的浓度下抑菌圈直径为9 mm，为低度敏感。含氮杂环酸柏木酯对大肠杆菌在5.0 mg/mL的浓度下抑菌圈直径在10 mm以上，为中度敏感。经过结构修饰的吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯对大肠杆菌均有良好的抑制效果。3种样品对大肠杆菌的抑制效果顺序为喹哪啶酸柏木酯>吲哚-3-羧酸柏木酯>柏木醇。

3 结论

通过DCC/DMAP催化酯化合成了两种含氮杂环酸柏木酯，滤纸片法抑菌活性研究表明，柏木醇及含氮杂环酸柏木酯均具有良好的抑菌活性，柏木醇对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在5.0 mg/mL的浓度下即可达到中度敏感。含氮杂环酸柏木酯对大肠杆菌有着良好的抑制作用，在5.0 mg/mL的浓度下抑菌圈直径均在10 mm以上，为中度敏感，而柏木醇在同等浓度下只为低度敏感。经过结构修饰的含氮杂环柏木酯具有良好的生物活性，具备进一步研究作为广谱抗菌剂的价值。