原发、复发及转移胃肠道间质瘤KIT及PDGFRA突变与临床病理特征间的关系

顾怡瑾，李安琪，董 磊，许海敏，申 霞，谢嘉玲，袁 菲，王朝夫

（上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科，上海 200025）

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，占胃肠道肿瘤的1%～4%[1]。原癌基因KIT 和血小板源性生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA) 基因检测不仅在原发性GIST 诊断及其与梭形细胞肿瘤等鉴别诊断方面具有辅助价值，在预测患者分子靶向治疗药物疗效上均具有重要意义[2]。虽然手术切除是目前治疗GIST 的首选方法，然而很多患者在初次诊疗时即存在转移性GIST[3]。此外，部分原发性GIST 患者在使用了靶向药物后亦会出现肿瘤复发或转移。本研究拟观察这部分患者肿瘤组织中KIT、PDGFRA 基因的突变状态，以期为晚期GIST 患者提供更多治疗机会。

有研究示，携带不同基因变异类型的GIST 患者可能表现出不同的临床特点和预后[4]。针对不同基因变异，美国食品药品监督管理局批准用于GIST 治疗的靶向药物不同。目前，一线靶向药物甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate，IM）是KIT 和PDGFRA 激酶域的ATP 结合区竞争性抑制剂，其可阻碍底物磷酸化和信号转导而抑制GIST 生长。携带KIT 基因外显子11 突变的患者对IM 治疗敏感[5]，其中携带KIT 基因外显子11 缺失突变的GIST患者，与未接受IM 治疗的患者相比，其无复发生存时间显著延长[6]。然而，IM 治疗携带KIT 基因外显子9 突变的GIST 患者的疗效较差，针对此类突变可使用二线靶向药物[如舒尼替尼（sunitinib）]进行治疗[7]。KIT 基因外显子13 和外显子17 突变是GIST 二次继发性突变的特征，二线靶向药物舒尼替尼对治疗携带KIT 基因13 号外显子V654A 点突变的GIST 有效，而三线靶向药物瑞戈非尼（regorafenib）则可有效治疗KIT 基因外显子17 二次继发性突变的GIST 和对IM、舒尼替尼治疗后发生耐药的GIST 患者[8-9]。近年来，阿泊替尼（avapritinib）靶向药物的研发也为非KIT 外显子突变及携带PDGFRA 外显子18 突变（包括PDGFRA D842V 突变）的不可手术切除或转移性GIST 患者带来了治疗机会[10-12]。因此，评估不同类型KIT 和PDGFRA 基因不同突变模式在临床诊疗中具有重要价值。

本研究收集了上海交通大学医学院附属瑞金医院收治的167 例原发GIST 患者，其中22 例存在肿瘤复发及转移。本研究运用第一代测序技术对GIST 的原发灶、复发及转移灶进行KIT、PDGFRA基因突变检测（KIT 基因为第9、11、13、17 号外显子，PDGFRA基因为第12、18号外显子），总结GIST 中KIT 和PDGFRA 基因的突变频率及类型，并进一步分析其与临床病理特征之间的相关性，为GIST 个体化治疗、预后预测提供参考。

资料与方法

一、资料

收集2004年3 月至2020年12 月期间上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科诊断为167 例原发性GIST 的肿瘤组织石蜡标本，其中22 例为复发或转移灶。所有标本对应患者的临床资料均完整。根据中国胃肠道间质瘤诊断治疗专家共识（2017年版）[13]，分类整理其病理组织学类型、肿瘤部位、直径及核分裂数及免疫组织化学（免疫组化）染色结果（DOG1、CD117、CD34 和Ki-67）。

二、方法

1.免疫组化检测：所有手术切除样本均经4%中性甲醛固定，常规脱水后，行石蜡包埋，3 μm 厚切片。采用Dako Omnis 自动免疫组化平台进行En Vision 法染色，一抗均使用Dako FLEX 即用型抗鼠或抗兔一抗，CD117[阳性定义为细胞膜和（或）细胞质染色]、DOG1[阳性定义为细胞膜和（或）细胞质染色]、CD34[阳性定义为细胞膜和（或）细胞质染色]、Ki-67（阳性定义为细胞核染色）。每批染色均设阳性对照和空白对照。

染色结果按染色强度（判定标准，细胞无着色为0 分，浅黄色为1 分，黄色至棕褐色为2 分，深黄色为3 分）和阳性细胞所占百分比进行计量，两者乘积>3 分为阳性[14]。所有结果均经3 位病理医师独立进行评判。所用免疫组化抗体、染色条件、设备及检测系统见表1。

表1 免疫组化检测所用抗体、染色条件、设备及检测系统

2.第一代测序技术检测：采用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒说明书提取基因组DNA，以DNA 为模板进行PCR 扩增及毛细管基因分析仪测序。本研究对KIT 基因第9、11、13、17 号外显子和PDGFRA 基因第12、18 号外显子进行测序[15]。测序结果与基因库KIT及PDGFRA 基因参考序列进行比对。

3.第二代测序技术检测：采用上海真固生物科技有限公司（包括胃肠道肿瘤35 个基因）第二代测序试剂盒制备文库，用MiSeq 4000（Illumina）平台对基因组DNA 文库进行测序，并进行生物信息分析其基因组变异。

4.临床资料及随访：复发及转移患者的中位随访时间为64 个月（10～172 个月），根据基因突变模式分析临床病理特征（如年龄、性别、免疫组化结果），观察KIT、PDGFRA 基因突变状态与上述临床参数间的相关性。

5.统计学方法：应用Graphpad prism 8.0 软件进行统计学分析，采用Mann Whitney 检验或Fisher精确概率法分析基因突变与临床病理特征间的关系，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、临床病理特征

167 例原发性GIST 患者中男性有79 例，女性有88 例，年龄为16～85 岁，中位年龄为61 岁。肿瘤的原发部位以胃（90/167，53.9%）为主，其次为小肠（45/167，26.9%），随后为结肠直肠（3/167，1.8%）、胃肠道外（29/167，17.4%）。本研究活检标本有14 例，肿瘤切除标本153 例；切除肿瘤最大径为0.2～30.0 cm，中位直径为5.5 cm。免疫组化结果包括CD117 阳性（98.8%，163/165），DOG1 阳性（99.4%，164/165），CD34 阳性（88.3%，144/163），Ki-67 增殖指数范围0～80%，22 例复发转移患者随访时间为10～172 个月，中位随访时间64 个月。

二、原发灶基因突变特征

1.基因突变与临床病例特征的关系：KIT、PDGFRA 基因突变患者与野生型GIST 患者之间的各临床病理学特征均无统计学差异（见表2）。

2.基因突变率：KIT 和PDGFRA 基因在167 例原发性GIST 患者中的突变率分别为83.8%（140/167）和3.0%（5/167）。

3.KIT 基因突变：KIT 突变分别位于外显子11（74.9%，125/167），外显子9（8.4%，14/167）和外显子17（0.6%，1/167）。KIT 突变类型主要以缺失突变为主（40.7%，57/140），其他突变类型包括点突变（34.3%，48/140）、插入突变（9.3%，13/140）、重复突变（3.6%，5/140）、混合突变（插入合并缺失，12.1%，17/140）。KIT 外显子11 突变中，以点突变V559D最为常见（11.2%，14/125），其次为W557_K558 密码子的缺失突变（6.4%，8/125）。与携带KIT 外显子11 点突变的GIST（n=45）相比，KIT 外显子11非点突变（缺失、插入、重复突变等）类型的GIST（n=76）组织中Ki-67 增殖指数更高（P=0.005 2）（见图1）。

KIT 外显子9 突变以Y503_F504 密码子的插入突变为主（50%，7/14）。KIT 外显子17 存在1 例点突变。

本研究中有1 例标本采用第一代测序技术检测结果，难以解读KIT 外显子11 突变（见图2A），故采用第二代测序检测分析，提示KIT 外显子11上存在2 段碱基缺失，导致氨基酸p.K550_Q556delinsW（见图2B）。

4.PDGFRA 基因突变：5 例PDGFRA 基因突变均位于外显子18，其中4 例为D842V 点突变，突变百分比为2.4%（4/167）；1 例为缺失突变。

三、复发及转移GIST 的临床病理和基因突变特征

22 例发生复发（n=4）或转移（n=18）的原发GIST 病灶以小肠为主（14/22），转移灶以肝脏及腹膜后转移更为常见。19 例复发及转移灶存在KIT突变，以缺失突变为主，无PDGFRA 突变，其中9 例为KIT 双外显子突变；5 例为KIT 单外显子突变。另有5 例对其原发灶及复发转移灶同时进行了KIT 外显子检测，其中4 例突变模式与其原发灶一致，1 例转移灶为KIT 外显子11 突变类型（p.N567_L576del），与其原发灶不同（p.E554_V560del，转移灶中肿瘤细胞以梭形细胞为主，而原发病灶则呈梭形细胞合并上皮样形态的细胞）（见图3）。

图3 1 例2011年GIST 原发灶与2017年复发灶的病理图及第一代测序技术检测结果

四、KIT 基因突变模式与临床病理参数

检出的9 例KIT 双外显子突变均见于复发及转移GIST，其中6 例为外显子11 和17 双突变，2 例为外显子11 和13 双突变，1 例为外显子9 和13 双突变。9 例KIT 双外显子突变除1 例KIT 外显子9 和13 双突变的GIST 患者无用药史，其余8 例双突变患者均有伊马替尼用药史，随访时间为24～172 个月，中位随访时间108 个月。除1 例单突变患者原发时间失访外，其余发生复发及转移的KIT单突变患者（n=9）随访时间为10～134 个月，中位随访时间为60 个月。

野生型GIST 患者（n=3）的随访时间为19～61 个月，中位随访时间为30 个月。22 例复发、转移患者中，与KIT 单外显子突变患者和野生型患者相比，KIT 双外显子突变患者的无疾病进展时间较长（P=0.029 9 和P=0.011 1）（见图4），但Ki-67 增殖指数、肿瘤直径及核分裂象与前二者比较，无统计学差异。

图4 9 例KIT 基因双外显子突变与9 例单外显子突变及3 例野生型GIST 患者的无疾病进展时间比较

讨 论

一、原发GIST 基因突变特征与临床病理特征间的关系

本研究运用第一代测序结合第二代测序技术回顾分析了167 例原发GIST 患者的病灶及其中22 例复发及转移转移灶，较全面反映了GIST 中KIT 和PDGFRA 基因在我国GIST 患者中的突变特征。本研究中携带KIT 基因突变的GIST 患者占83.8%，其突变主要位于外显子11，突变类型以缺失突变最为常见。PDGFRA 的突变频率（3.0%）略低于既往报道的5%～7%[17]。

1.KIT 基因外显子11 突变率高且缺失突变常见：既往文献对GIST 中基因突变状态的解析提示，不同KIT 突变的GIST 生物学行为的表现亦不同。本研究结果示，携带KIT 外显子11 非点突变类型的GIST，其Ki-67 增殖指数较携带点突变病例显著增高。Wang 等[18]报道了KIT 外显子11 缺失密码子≥2 个的患者其无复发生存时间显著短于携带KIT 缺失单个密码子的GIST 患者。KIT 密码子W557_K558 缺失突变是本研究中KIT 外显子11上最为常见的缺失突变位点。既往文献报道示，W557_K558 缺失突变可能与较高的肿瘤复发、转移风险相关。此外，这类GIST 还往往具有肿瘤直径大、核分裂数量多的特点[19-20]。据此，深入分析GIST中KIT 突变类型有望为GIST 患者预后预测提供更多信息。

本研究未发现GIST 中2 个基因突变的特征与患者年龄、性别、肿瘤直径、核分裂数量及危险分级间有相关性，可能是受部分检测样本类型为活检组织的影响。同时，本研究观察了GIST 基因突变类型与肿瘤原发部位的关系，发现携带KIT 外显子9 突变的GIST 更常见于小肠（10/14），而携带PDGFRA基因突变的GIST 则主要发生于胃部（4/5），与以往研究结果一致。

2.KIT 基因外显子11 非点突变时伴Ki-67 增殖指数升高：Ki-67 是评判肿瘤细胞增殖活性的标志物，在指导乳腺癌和神经内分泌肿瘤的临床治疗中具有重要意义。尽管在中国胃肠道间质瘤诊断治疗共识中并未明确Ki-67 在GIST 诊断及治疗中的价值[21]，但早在2012年Artigiani Neto 等[22]学者即提出，Ki-67≥10%的GIST 发生复发或转移的风险更高。近期文献显示，Ki-67 高表达是GIST 患者无复发生存的独立预后因素[23]，进一步证实了Ki-67 在预测GIST 生物学行为中的价值。本研究结果示，原发灶KIT 基因外显子11 非点突变类型的肿瘤患者，其Ki-67 增殖指数高于点突变类型，可能提示该类GIST 的生物学行为更差。

3.第二代测序技术辅助碱基序列判读：目前，第一代测序技术在发现KIT 和PDGFRA 基因突变中具有较强的可操作性，但在遇到复杂突变时，第二代测序技术在辅助判读碱基序列变化中更具优势。本研究报道的1 例复杂突变采用第二代测序技术精准且直观地展现了KIT 基因的突变形式，即氨基酸p.K550_Q556delinsW。目前第二代测序技术已被引入GIST 的Ⅲ期临床试验中，期望挖掘出更多与靶向治疗相关的基因突变[24-25]。

二、复发及转移GIST 的基因突变特征

1.复发灶中存在KIT 基因双外显子突变提示预后较好：本研究的复发及转移GIST 患者中约有86.4%携带KIT 基因突变（19/22），无PDGFRA 基因突变。突变模式分析提示，有9 例GIST 患者携带KIT 基因双外显子突变，其中6 例携带KIT 外显子11 突变的同时还携带外显子17 的820_830 密码子位置的错义突变，另3 例携带KIT 外显子11 突变的同时存在外显子13 的V654A 或M651V 的错义突变。

尽管既往文献提示，KIT 基因继发性双突变会造成GIST 患者靶向治疗过程中的耐药及肿瘤转移[26]，但本研究中KIT 双外显子突变GIST 患者的无疾病进展时间较KIT 单突变及野生型GIST 患者均显著延长，这一结果与Bosbach 等[27]所构建的GIST 双突变鼠（携带KIT V558 和T669I）较单突变（KIT V558）的小鼠模型中位生存时间延长的结果相符。鉴于本研究中GIST 复发、转移病例数较少，KIT 双突变在评估GIST 患者预后中的价值仍有待进一步验证。

2.转移灶KIT 基因突变位点与原发灶不同：本研究同时关注了复发及转移GIST 中KIT、PDGFRA基因的突变情况，发现1 例GIST 肝脏转移灶携带的KIT 突变不同于十二指肠原发灶。前期鉴于其部分区域相似的HE 形态和一致的免疫组化表型，本研究推测其原发肿瘤转移至肝脏的可能性更大。目前认为，肿瘤起源表现为单克隆，但亦不排除原发肿瘤存在基因变异的异质性[28]。Xu 等[29]报道了多发性GIST 同时携带不同KIT 突变的病例，提示该肿瘤存在多克隆起源。此外，该研究也报道了同一病例在不同时间段诊断的GIST 携带的KIT 突变不同，结合形态不能排除新发的可能性。因此，对于再发病例除考虑肿瘤转移或复发外，也需考虑二次原发的可能性。

总之，本研究运用第一代测序技术回顾分析原发、复发及转移GIST 组织中KIT 和PDGFRA 的突变频率和突变类型，揭示了GIST 中基因突变与肿瘤临床病理特征之间的关系。GIST 多存在KIT 基因或PDGFRA 基因突变，不同KIT 基因突变类型的Ki-67 增殖指数可作为评估GIST 生物学行为的指标之一。检测GIST 中的基因状态，根据基因突变特征对GIST 患者实施个体化精准治疗并进行预后评估具有重要意义。