血管内皮生长因子对青光眼的视神经保护机制的研究进展

孙 俊，余 欢，黄守约

（上海交通大学医学院附属瑞金医院眼科，上海 200025）

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种通过二硫键结合的同型二聚体糖蛋白，因其具有诱导血管形成、增加血管通透性、调节淋巴管生成和促进神经发生并保护神经等多种作用，已成为了目前心血管、肿瘤、神经系统和眼科等领域的研究热点[1]。青光眼是以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）变性及典型的视盘改变为特征的退行性视神经病变，病理性高眼压为其主要危险因素，最终将导致不可逆性眼盲。

2015年的研究报道显示，我国罹患青光眼的人数约为1 312 万，预计到2050年，患者人数将增长到约2 516 万，严重损害人群的健康，并显著增加了公共卫生成本和社会经济负担[2]。

青光眼的发病机制可能涉及眼压的增高、供血不足、组织缺氧、氧化应激、神经胶质细胞的免疫应答及自噬相关机制，但仍尚未完全阐明[3]。采用药物、激光和手术等方式控制眼压，是目前临床仅有的可有效延缓青光眼病程进展的方法，但仍有很多患者，即使眼压控制良好，其青光眼视神经病变导致的视觉功能恶化也无法减缓。可见，视神经保护策略一直是青光眼治疗中的重点和难点。近年来，体外实验及动物实验研究发现，VEGF 可维持轴突运输、抑制炎症反应和减轻氧化应激等，从而抑制青光眼动物模型中的RGC 凋亡，提示VEGF 可能具有视神经保护作用，表明其在青光眼治疗领域有一定的应用潜力。本文总结近年来国内外关于VEGF 对青光眼的神经保护作用的研究进展及相关背景，旨在为基础和临床研究提供参考。

VEGF 的分类和功能

一、VEGF 分类

1983年，Senger 在培养有豚鼠肿瘤细胞系的培养液中发现一种能强力诱导血管生成的物质，并将其命名为血管通透因子。1989年，Ferrara 等[4]从牛垂体滤泡细胞中分离了一种促有丝分裂的肝素结合蛋白，命名为VEGF。cDNA 和蛋白质序列分析结果显示，血管通透因子与VEGF 是同一种物质。目前已发现的VEGF 家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF）、VEGF-E（由副痘病毒属基因编码）和VEGF-F（在蛇毒中发现）[5]。

VEGF 可与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）特异性结合而发挥生物学效应。VEGFR 包括其同源受体酪氨酸激酶受体（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3）、神经纤毛蛋白（Neuropilin，NRP）-1 和NRP-2，及非酪氨酸激酶受体（硫酸乙酰肝素和整联蛋白）。

二、VEGF 家族成员及功能

1.VEGF-A：在很多文献中，VEGF-A 也被直接称为VEGF[6]，其在生理性和病理性血管生成过程中占主导地位。根据转录过程中外显子剪接的不同，VEGF-A 被分为VEGFA 121、VEGF-A 165、VEGF-A 189 和VEGF-A 206 等多种亚型[1]，这些亚型间的主要区别为它们与肝素的结合能力不同。VEGF-A 可与VEGFR-1、VEGFR-2 结合。VEGFR-1 与VEGF-A 结合后，可增强炎症细胞（巨噬细胞等）的吸引和迁移。与VEGFR-1 相比，VEGFR-2 与VEGF-A 的亲和力较低，但其与VEGF-A 结合后的血管生成作用约为VEGFR-1 与VEGF-A 结合后的10 倍，因此VEGFR-2 其实是主要的信号受体。VEGFR-2 主要在血管内皮细胞中表达，促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成。

2.VEGF-B 和PIGF：VEGF-B 和PIGF 只能特异性结合VEGFR-1。VEGF-B 在血管生成调节方面的作用不大，其在维持心肌和冠状动脉系统正常功能方面发挥重要作用。近年来有研究发现，VEGF-B 能直接作用于神经元，通过抗氧化应激发挥神经保护作用[7]。PIGF 则可直接与VEGFR-1 结合，也能以置换VEGF-A 和形成PIGF/VEGF-A 复合物的形式影响内皮细胞的生长、迁移和存活[8]。

3.VEGF-C 和VEGF-D：VEGF-C、VEGF-D 与VEGFR-3、NRP-2 亲和力高，因此它们组成VEGF-C/D-VEGFR3/NRP2轴，可调节费林蛋白酶、接触蛋白1 和趋化因子受体4 等信号分子产生级联效应，在淋巴管生成和肿瘤细胞的淋巴转移中发挥重要作用[9]。施莱姆管的发育及其屏障结构和功能的完整性都依靠VEGF-C/VEGFR3 的诱导和维持，是房水流出通道发生、发育的关键因素，与眼压高低密切相关[10]。

VEGF 在青光眼患者中的视神经保护作用机制

青光眼视神经损害的机制尚未完全阐明，眼压升高、视神经头的供血不足和神经退行性变是目前的主流学说[11]，其机制也涉及视神经轴突运输障碍、内源性和外源性凋亡信号通路的激活、线粒体功能障碍、氧化应激和神经炎症等[3]。

一、促神经发生及促血管生成

关于VEGF 神经保护机制的研究目前集中于其通过增加血流灌注以促进神经细胞存活、抑制细胞凋亡和促进神经再生等方面，在神经系统疾病和眼部疾病的相关研究中均有体现[12]。VEGF 可直接作用于视神经元，刺激神经干细胞增殖并促进神经发生[13]，也可通过促血管生成作用间接促进神经发生。在神经损伤的病理情况下，巨噬细胞可迁移到轴突间隙中，分泌VEGF 诱导血管形成，从而使施万细胞（Schwann cell）能利用这些血管迁移到轴突间隙中，实现轴突再生[14]。在人眼内，血管内皮细胞、周细胞、视网膜神经元、星形胶质细胞、米勒细胞、小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞和睫状体非色素上皮细胞均能产生VEGF[1,15]。目前的研究认为，VEGF 一般局限于其产生的部位发挥作用，而不会扩散到其他部位[16-19]。

二、VEGF-A 可维持视神经轴突运输来保护视神经

RGC 凋亡是青光眼发病机制中公认的病理基础。RGC的细胞体位于内侧视网膜，轴突位于视神经中。VEGF 可维持轴突运输、抑制炎症反应和减轻氧化应激等来抑制青光眼动物模型中的RGC 凋亡，达到对青光眼动物的视神经保护作用。张水华等[17]发现，视神经挤压伤小鼠模型中视网膜组织的内源性VEGF 表达增多，且在玻璃体腔内注射重组人VEGF 治疗后，存活的RGC 数量可显著增加，提示VEGF 对受损的小鼠视神经具有保护作用。内源性VEGF-A 能抑制青光眼RGC 的凋亡[18]。Nishijima 等[19]的研究则发现，补充外源性VEGF-A 亦能有效抵抗缺血-再灌注损伤导致的视网膜神经元凋亡，而在玻璃体腔注射抗VEGF 药物后，RGC 数量随VEGF 浓度的降低而减少，且呈剂量依赖性，神经元轴突运输的组成及VEGF-A 的作用如下。

1.神经元轴突运输的结构组成和功能：神经元轴突运输包括微管、马达蛋白和运输的神经营养物质[20]。微管是道路，马达蛋白则是运载物质的交通工具。马达蛋白分为两类，一类是负责将细胞器、囊泡等从神经元胞体运往轴突末端，即参与顺向轴突运输过程的驱动蛋白家族；另一类是负责将物质从轴突末端运往神经元胞体，即参与逆向轴突运输过程的动力蛋白[21]。微管异常的原因包括年龄等因素导致的微管数量减少，以及Tau 样蛋白和α-synuclein 突触前蛋白等导致的微管装配解离失衡。微管、马达蛋白或运输的神经营养物质异常均可影响正常的轴突运输，从而损害正常神经功能。

2.VEGF-A 维持生理性轴突运输：神经元轴突运输障碍是青光眼疾病进程中的早期病理改变，其先发生于远端轴突终止的上丘，再逐渐向近端发展[22]。Foxton 等[23]研究发现，应用抗VEGF 药物可导致部分轴突运输能力丧失，该作用发生于RGC 数量减少前。杨平等[24]发现，VEGF 可以由神经元囊泡释放，与驱动蛋白1B 结合后实现顺行轴突运输，发挥维持神经元活性和促进轴突生长的作用。因此，VEGF-A 在细胞的正常生理机制中可能起着维持突触结构和轴突运输功能的作用。

（1）调节P38/热休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）维持轴突运输：结合VEGF-A 后，VEGFR-2 会自磷酸化，其中一个自磷酸化位点结合cdc42,调节下游的P38 和Hsp27 信号通路，从而影响到轴突运输。Foxton 等[23]发现，小鼠玻璃体腔注射抗VEGF 药物后，磷酸化的p38 和Hsp27在整个内层视网膜的表达显著增多。p38 是丝裂原激活蛋白激酶家族中的一员，在青光眼动物模型的视网膜中，特别是RGC 中表达增多，如其在大鼠青光眼模型增中加了2～3 倍，在小鼠青光眼模型中则增加约3 倍[25]。Hsp27 是热休克蛋白家族的一员，通常被认为具有维持蛋白稳态、抗细胞凋亡和神经保护的作用。但研究发现，向大鼠眼部玻璃体内注射Hsp27 能导致RGC及其轴突变性，提示Hsp27 参与了青光眼的发病[26]。

（2）调节磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路促进轴突生长：VEGF-A/VEGFR-2 复合物可以结合Src 蛋白和Src 同源蛋白β，从而激活下游的磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶信号通路。该信号通路能抑制bcl 相关死亡蛋白质和胱天蛋白酶9，从而抑制青光眼模型中RGC 的凋亡，同时也能激活内皮型一氧化氮合酶和叉头框蛋白O1，促进细胞存活和轴突生长[27-28]。Shen 等[18]设计了2 种新的VEGF 变异体——eVEGF-38 和eVEGF-53，其能上调NRP-1 和微管相关蛋白质1B 等基因表达，促使RGC 轴突增长约12 倍，同时也能提高胚胎干细胞向RGC 转化的效率，有望成为RGC 和视神经损伤的潜在治疗方法。

关于VEGF-A 在视神经轴突运输中的作用及其相关信号通路的具体调节机制，目前尚未完全明确，需要进一步行更详尽和深入的研究。

三、VEGF-B 保护视神经的作用机制

1.抑制细胞凋亡：线粒体功能障碍、蛋白质折叠异常以及蛋白酶体降解系统的缺陷等因素均可导致活性氧水平升高，并进一步通过DNA 损伤和蛋白质修饰等方式促使RGC凋亡[29]，而在青光眼动物模型中应用叶黄素和玉米黄素等抗氧化剂能，减轻高眼压引起的视网膜损伤[30]。Li 等[31]在视神经挤压损伤小鼠模型中观察到内源性VEGF-B 表达增多，并进一步在视神经挤压损伤、N-甲基天冬氨酸诱导的视网膜损伤和脑缺血中风的动物模型中，应用外源性VEGF-B 补充治疗，结果发现VEGF-B 可与VEGFR1 结合，从而抑制唯BH3蛋白基因和其他凋亡相关基因的表达，进而抑制神经元的凋亡。其中的关键环节唯BH3 蛋白，是Bcl-2 蛋白家族中的一类仅含有BH3 同源区域的促凋亡分子，是启动细胞凋亡的关键上游调节因子，其活性主要在转录水平上调节[32]。

2.上调关键抗氧化基因：导致青光眼RGC 死亡的机制复杂多样，由活性氧与抗氧化剂之间的失衡引起的氧化应激是其中的关键因素之一。VEGF-B 可上调的抗氧化基因，包括谷胱甘肽过氧化酶、家族、超氧化物歧化酶、硫氧还原蛋白过氧化物酶类、硫氧还蛋白还原酶家族和含MYND 结构域的锌指蛋白17 等[7]。VEGF-B 能上调这些重要抗氧化基因的表达水平，保护RGC 免受氧化应激诱导的损伤。

VEGF 相关青光眼研究的内容及方向展望

青光眼是多因素、多机制共同作用引起的视神经退行性疾病，其导致视神经损伤的机制可能涉及眼压增高、血液循环不足、组织缺氧、神经营养物质的丢失、兴奋性中毒、氧化应激、神经胶质细胞的免疫应答及自噬相关机制等。VEGF对青光眼的视神经保护作用即是对青光眼病程中视神经损害相关综合因素的拮抗，上述机制均有待进一步的研究。

一、VEGF 与缺氧刺激间的关系

生理情况下，VEGF 呈低水平表达，而低氧等刺激因素可诱导缺氧诱导因子1α及其下游靶基因（一氧化氮合酶等）的转录激活，从而提高VEGF 表达水平，以改善氧气和营养供应[33]。RGC 等神经元在缺氧时可分泌碱性成纤维细胞生长因子和血小板源性生长因子等，调节VEGF 的分泌，从而刺激血管生长，以满足组织的代谢需求，并实现内环境平衡。缺氧是青光眼发病机制中的一个重要环节，因此有理由相信在青光眼病理状态下，VEGF 的表达水平会受到缺氧因素诱导而增加，但是否会同时加强引入VEGF 的视神经保护功能尚不明确，需待进一步研究明确。

二、VEGF 与小胶质细胞间的关系

在青光眼等慢性神经炎症性病变中，小胶质细胞的激活通常被认为是有害的，因其具有促炎作用。目前已知的研究一般公认，小胶质细胞的激活发生在青光眼RGC 损伤之前,其激活后造成RGC 损伤的机制可能包括促炎因子的释放、氧化应激、多种补体分子表达升高等[34]。VEGF 能与小胶质细胞上的VEGFR 特异性结合，从而激活小胶质细胞，神经元和星形胶质细胞表面亦分布有VEGFR，且神经细胞自身便具有合成VEGF 的功能。小胶质细胞分泌的肿瘤坏死因子α 则能够增加VEGF 的表达，也能通过p38 信号转导途径、c-Jun 氨基末端激酶和核因子κB 发挥促炎和增加血管生成活性的作用[35]。小胶质细胞分泌的白细胞介素（interleukin，IL）-1β 也可经Src 蛋白依赖性途径和丝裂原激活蛋白激酶、胞外信号调节激酶信号途径诱导VEGF 表达上调，而VEGF 和IL-1β 均能促血管生成和血管通透性增加[36]。另外，也有研究报道，小胶质细胞直接产生的VEGF-B 能激活星形胶质细胞上的VEGFR-1，从而促进神经炎症的发生、发展[37]。上述研究结果提示，VEGF 极有可能通过小胶质细胞间接参与了青光眼视神经病变的进程，但其具体机制如何，有待未来进行深入的研究发掘。

结 语

尽管VEGF 的神经保护作用在多种动物模型中得以验证，但在青光眼领域的相关研究成果很少，且目前研究局限于VEGF-A 和VEGF-B，仍需大量基础实验探究青光眼动物模型中VEGF 的神经保护作用机制。考虑到VEGF 是一个具有多重功能的生长因子，其有促进新生血管生成和血管通透性增加等的作用不容忽视，如何在特异性地发挥其神经保护作用的同时，弱化其促血管生成功能，仍需要进行大量实验研究探索。相比其他VEGF 家族成员，VEGF-B 的血管生成作用更弱，可能有望作为该研究方向的潜在突破口。

目前，直接阻断VEGF 作用的抗VEGF 药物，如雷珠单抗、康柏西普和阿柏西普等已，广泛应用于新生血管性年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病和新生血管性青光眼等眼科疾病的治疗。部分研究发现，接受抗VEGF 药物治疗后患者存在持续性高眼压、视神经损害等病理现象，但抗VEGF 药物的安全性仍被大部分临床医师认可[15,38]。如未来以VEGF 作为神经保护因子应用于临床眼科疾病的治疗，将会对眼科医师对疾病机制的理解和药物使用指征的把握提出更高的要求，需在临床实践中进一步完善和提高。随着更详尽和深入的研究，相信VEGF 未来能够在青光眼的视神经保护治疗领域发挥重要作用。