添加乳酸菌和纤维素酶对砂仁叶青贮品质的影响

郑明扬，吴 硕，郭 香，陈晓阳，张 庆

(华南农业大学林学与风景园林学院，广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州, 510642)

砂仁(Amomumvillosum)属于姜科豆蔻属多年生草本植物，是我国“四大南药”之一，收录于《中华人民共和国药典》(2010年版)[1]。原产地中国，品种主要有‘阳春砂’、‘绿壳砂’和‘海南砂’[2]。现代科学表明砂仁有一定的胃肠保护、抗溃疡、镇痛、消炎、止泻、抑菌和抗氧化作用等[3]。Wang和Zhang等[4-5]报道砂仁精油能显著降低胃酸、胃蛋白酶活性，抑制胃酸分泌和细菌增殖，保护胃肠粘膜，调节胃肠运动。砂仁主要成份为挥发性成分，次要成分为非挥发性成分。其挥发油主要由醋酸冰片(5%～47%)、樟脑(4%～17%)、冰片(1.5%～6%)等组成。非挥发性成分主要由多糖、皂苷类、黄酮类、有机酸、酚类等组成[6-7]。砂仁拥有非常多的有益活性成分，可作为饲料添加。李乔仙等[8]发现砂仁鲜茎叶适口性好、营养价值高，可作为牛、羊等草食动物的青贮饲料。韩建成等[9]发现在饲料中添加10%的砂仁茎叶，对雷州黑山羊的生长有积极作用。闫长东[10]发明了一种新型砂仁饲料(最外层由砂仁粉构成)，能提高家禽的食欲和提高饲料的营养品质。

青贮前期pH值能否快速下降对青贮品质影响至关重要。通过添加乳酸菌制剂能迅速降低pH值，乳酸菌在发酵前期与其他菌种竞争中获得优势并抑制有害微生物的活性从而提升青贮饲料的发酵品质[11]。纤维素酶和木聚糖酶等酶制剂常用于改善粗饲料的青贮品质[12]。添加纤维素酶，能使纤维水解为葡萄糖[13]，增加乳酸菌的发酵底物。木聚糖酶可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。同时添加乳酸菌和纤维素酶，能帮助pH快速下降，这也是青贮技术发展的一种热门趋势[14]。

当前对砂仁的研究主要集中在挥发油成分的鉴定上，而对精油提取后残渣的利用关注较少。将提取完砂仁精油后的砂仁叶残渣作为青贮饲料的原料，可以提高砂仁的利用价值，有效缓解家畜饲料短缺的情况[15]，对砂仁叶残渣作为青贮饲料原料方面，也暂无相关文献报道。

因此，本试验通过对提取精油之后的砂仁叶添加乳酸菌和纤维素酶进行青贮处理，来探究添加不同浓度的纤维素酶和乳酸菌，或者纤维素酶和乳酸菌同时添加对砂仁叶青贮品质的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

砂仁叶为精油提取后的剩余材料，由阳江市百盛园实业有限公司生产赠予。纤维素酶和木聚糖酶均购于湖南盛东生物科技有限公司，纤维素酶的酶活为2×104U·g-1、木聚糖酶的酶活为2×105U·g-1。

1.2 试验设计

本试验采用完全随机区组试验设计，因素一为是否添加乳酸菌LF，添加的剂量为1×106cfu g-1鲜样(Fresh matter，FM)，因素二为不同的酶处理(分别为0.3%纤维素酶、0.6%纤维素酶、0.2%木聚糖酶、0.4%木聚糖酶)。砂仁叶切碎(长约2 cm)进行青贮处理，添加乳酸菌LF(参照Zhang[16]的研究筛选所得)和不同水平的酶制剂，共10组，每组3个重复，共30袋青贮。CK为对照组(添加等量纯水)。饲料混合均匀后，放入实验室聚乙烯袋(20 cm×30 cm)，然后用真空封口机进行封口，放置在室温下。青贮30 d后开袋，测定砂仁叶青贮品质和营养物质的各项指标。测定方法参照王成[17]的研究并加以适当修改和补充。

1.3 微生物及化学指标的测定

30 d开袋后，取10 g样品与90 mL灭菌后的生理盐水(0.9% NaCl)充分混合，之后取1 mL浸取液加入装有9 mL灭菌生理盐水的试管中，以此方法依次将浓度稀释为10-2到10-6倍的浸取液。分别用配制好的MRS琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(Violet red bile agar,VRBA)和孟加拉红培养基(虎红琼脂)培养乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)、大肠杆菌、酵母菌以及霉菌，用平板计数法计算各自数量(培养基均来自广东环凯微生物科技有限公司)。测定pH值和有机酸含量的方式为：取10 g样品与90 mL灭菌后的生理盐水充分混合，于4℃冰箱中放置18 h后取出通过滤纸进行过滤，采用雷磁PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)测定pH值[18]。剩余液体用0.22 μm孔径的滤膜进行过滤，测定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)含量(岛津GC-14型高效液相色谱仪)[19]。

1.4 纤维和蛋白含量的测定

中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)含量的测定：参照Van Soest的方法[20]进行测定。

可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)的测定采用蒽酮比色法[21]。

粗蛋白质(Crude protein,CP)含量的测定：依据凯氏定氮法[22]，准确称量0.5 g砂仁叶干粉，加入适量浓硫酸和催化剂(硫酸钾和硫酸铜按5∶1的比例配置)进行消煮，用凯氏定氮仪进行测定。

真蛋白质(True protein,TP)含量的测定：称取0.5 g砂仁叶干粉，加入15%的三氯乙酸浸泡1 h，再用定性滤纸(无氮)进行过滤，将残渣无损的转移到滤纸上，把残渣连同滤纸一起烘干，按照CP的测定方法进行测定，即能测出真蛋白质的含量[23]。

非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)的含量：根据计算公式：NPN=CP-TP，测定CP和TP的含量后即可计算非蛋白氮的含量[23]。

1.5 数据统计

本试验的数据采用软件SPSS 19.0 进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，当需要分析两个因素的交互作用时，采用Duncan法对各组进行比较，P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 青贮原料的特点

由表1可知：砂仁叶青贮饲料干物质(Dry matter，DM)含量为28.3%；粗蛋白质含量为14.9% DM；NDF含量为70.2% DM；ADF含量为43.3% DM；WSC的含量为4.30% DM。乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌、霉菌数量分别为7.48，5.55，6.79和<2.00 log10cfu g-1FM。

表1 青贮原料的特点(± SD,n=3)

2.2 砂仁叶青贮30 d的青贮品质

由表2可知砂仁叶青贮30 d的青贮品质。添加LF和酶制剂(纤维素酶和木聚糖酶)，导致pH值极显著降低(P<0.01)，LA的含量极显著增加(P<0.01)。添加LF，LAB的数量略有降低，AA的含量极显著降低(P<0.01)；有害微生物方面，添加酶制剂后，酵母菌数量极显著降低(P<0.01)。结果表明，添加LF和酶制剂以及同时两种处理的交互作用对pH，LA，AA和LAB的含量都有极显著影响(P<0.01)。

表2 砂仁叶青贮30 d的青贮品质(n=3)

2.3 砂仁叶青贮30 d的营养成分

表3 砂仁叶青贮30 d的营养成分(n=3)

3 讨论

3.1 青贮原料的特点

砂仁叶原料中的DM含量接近30%，高于赵苗苗[25]报道的象草DM含量(20.43%)和刘刚等[26]报道的玉米DM含量(16.36%～27.14%)，根据Jessie[27]的报道30%～35%的DM含量最适合青贮。原料中WSC含量为4.30% DM，低于smith[28]的研究中所提到的优质青贮标准，WSC含量较低可能导致发酵底物不足，乳酸菌难以快速繁殖。若乳酸菌不能快速增殖并与有害微生物竞争营养物质成为优势菌群，可能会引起有害微生物的快速增殖进而引起有氧腐败[29]。根据李茂等[30]报道，热带灌木的NDF和ADF的平均值分别为38.83%，33.67%，而本试验中砂仁叶原料的纤维含量特别是NDF含量远大于这个平均值，说明砂仁叶纤维含量高，会影响饲料的适口性，纤维素酶的添加可在一定程度上降低NDF含量，为乳酸菌发酵提供底物。原料中乳酸菌的含量达到了7.48 lg cfu·g-1FM，高于Cai[31]报道的良好青贮饲料的标准(>5.0 lg cfu·g-1FM)，但是大肠杆菌的含量较高(6.79 lg cfu g-1FM)可能会影响饲料的青贮品质。

3.2 砂仁叶青贮30 d的青贮品质

pH值是衡量青贮品质的一个重要指标[32]，当pH值高于4.2时，可能会有更多腐败现象的产生[33]。本试验中最高pH值为4.26，其余处理组均低于4.2，说明本试验中的添加剂处理使砂仁叶达到较好的青贮品质。本试验中LAB数量减少可能是由于酸化过快导致pH值快速降低，使一些不耐酸的LAB活性受到抑制，Parvin和Nishino[34]也报道了类似的结果。LF的添加使LAB在青贮前期取得优势竞争地位，纤维素酶的添加使纤维水解，给乳酸菌增加了可发酵的WSC含量，所以LF和酶制剂的处理组中，LA的含量显著增加，这与Ebrahimi[35]报道的结果一致。酵母菌的产生可能代表着有氧腐败的开始[36-37]，酶制剂添加组中的酵母菌数量明显减少，可能是较低的pH值对酵母菌有抑制作用。同时，本试验中未见大肠杆菌和霉菌产生，说明青贮效果良好。

3.3 砂仁叶青贮30 d后的营养成分

4 结论

在本试验中，砂仁叶本身的纤维含量高，WSC含量较低，单独青贮难度较大。添加纤维素酶能将纤维素分解为WSC，解决了乳酸菌发酵底物不足的问题。试验结果表明：添加LF和2种纤维素酶使砂仁叶青贮的乳酸明显增加，而pH值、乙酸、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、氨态氮的含量明显降低，并且抑制了有害微生物酵母菌、大肠杆菌和霉菌。结果表明同时添加LF和0.6%纤维素酶或者同时添加LF和0.4%木聚糖酶都能明显提高砂仁叶的青贮品质，说明精油提取后的砂仁叶残渣能够再利用制作青贮饲料，提高了农副产品利用率。