Foxc2 基因对MC3T3⁃E1 细胞成骨能力影响的实验研究

王敏娇 司家文 沈洪洲 游清玲 沈国芳

Foxc2 作为Fox 家族C 亚家族中的一员，在真核生物中十分保守。Forkhead 蛋白在调控胚胎发育、代谢、免疫、应激反应以及分化调控等方面均发挥了重要的作用［1］。Foxc2 初期在小鼠胚胎头部的神经嵴、中胚层来源的间充质细胞以及躯干部的非脊索中胚层中广泛表达，而后在颌面部局限表达［2］。在关键成骨基因过表达或敲除的小鼠中可观察到面部发育异常，同时Foxc2 的表达也有相应的变化［3－4］。本研究拟选取小鼠前成骨细胞系MC3T3⁃E1，通过慢病毒及siRNA 转染改变其Foxc2 表达，明确Foxc2 的功能，并通过基因芯片技术筛查差异表达基因，探索参与相关通路的Foxc2 下游靶基因。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

MC3T3⁃E1 细胞（亚克隆14，中国科学院细胞库），α－MEM 培养基（Gibico，美国），血清（Gibico，美国），胰酶（Gibico，美国），成骨诱导液（Cyagen，美国），甲状旁腺激素（Sigma，美国），辛伐他汀（Sigma，美国），慢病毒载体（上海和元生物），siRNA（上海拓然生物有限公司，中国），实时定量PCR 试剂盒（TaKaRa，日本），PCR 引物（上海生工生物科技有限公司），Foxc2 抗体（Abcam，美国），GAPDH／Runx2 抗体（CST，美国），碱性磷酸酶显色试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司）。

荧光定量PCR 仪（ABI，美国），Odyssey 双色红外激光成像仪（LI－COR，美国），表达谱芯片（Agilent，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 MC3T3⁃E1 细胞的成骨诱导培养

以成骨诱导液、甲状旁腺激素（浓度10－8mmol／L）、辛伐他汀（浓度10－8mmol／L）诱导培养MC3T3⁃E1细胞。收集细胞样品，通过后续实验确认Foxc2 表达水平的变化。

1.2.2 慢病毒转染构建Foxc2 稳定过表达MC3T3⁃E1 细胞系

采用慢病毒plenti－Foxc2 及plenti－EGFP 转染MC3T3⁃E1 细胞构建MC3T3⁃E1Foxc2＋（实验组）及MC3T3⁃E1EGFP（对照组）。以2×105个／cm2的密度将MC3T3⁃E1 细胞接种于6 孔板中，次日更换为含5 μg／mL Polybrene 的无血清培养基。加入慢病毒感染靶细胞，感染24 h 后换成含10%FBS 的无抗生素α－MEM 培养基。培养72 h 后通过嘌呤霉素筛选获得Foxc2 稳转细胞株。

1.2.3 siRNA 干扰Foxc2 表达

采用siRNA 干扰技术构建MC3T3⁃E1si－Foxc2（实验组）及MC3T3⁃E1si－NC（对照组）。选用Lipo2000 为转染介质，待6 孔板内的细胞达到80%左右，开始转染。准备两只EP 管，A 管加入250μL Opti－MEM 和10μL 20 μmol／L 的siRNA 储存液，B 管加入250μL Opti－MEM（无血清）和5μL lipo2000，然后混匀AB两管，室温孵育20 min，形成siRNA／lipo2000 混合液，将以上混合液加入含有细胞的1 500μL 培养基的培养孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在37 ℃、5%CO2培养箱温育48 h，进行转染后的其他检测步骤。

1.2.4 CCK－8 试剂盒检测

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，制成细胞悬液，接种至96 孔板，每孔控制细胞数1 000 个左右，每组设4 个复孔。37 ℃、5%CO2条件下孵育培养7 d。每孔加入10μL 的CCK－8 溶液，轻轻敲击培养板使其混匀，37 ℃下孵育2 h，分别测量450 nm处每孔的光密度（OD）值。根据OD 值绘制增殖曲线。

1.2.5 流式细胞仪检测

周期：消化并收集两组细胞沉淀，预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜；次日再次收集细胞沉淀，PBS漂洗，以除去乙醇；调整细胞密度至1×109个／L，每个EP 管内加入300μL PI／RNase 混匀，避光孵育15 min 后，上流式细胞仪FACStar 进行检测。

凋亡：细胞培养达到85%融合时，将上清培养液收集到离心管内，PBS 漂洗，收集细胞沉淀于上一步的离心管内；将细胞重悬于1×buffer 中，分别加入5μL Annexin Ⅴ－PE 和5μL 7－AAD 染剂，避光室温孵育15 min。移入流式管，1 h 内流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 基因mRNA 以及蛋白表达检测

实时定量PCR：收集细胞，无菌预冷PBS 清洗2次，Trizol 提取细胞总RNA，并反转录合成cDNA，进行实时荧光定量反应。反应体系：上下游引物各0.5μL，cDNA 模板1μL，ROX 0.5μL，SYBR 10μL，加入DEPC 水7.6μL 补足，共计20μL。每组样本设3 个复孔。反应结束后，根据已检测的Ct值即循环阈，采用ΔΔCt 法计算基因相对表达量变化（表1）。

表1 实时定量PCR 引物序列Table 1 Primer oligonucleotide sequences used for real－time PCR

Western blot：RIPA 裂解液充分裂解细胞并提取总蛋白，BAC 蛋白试剂盒测定蛋白浓度，取20 μg 进行SDS－PAGE，再转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。然后加入荧光二抗室温避光孵育1 h，放入Odyssey 双色红外激光成像仪，扫描显色。

1.2.7 ALP 染色

采用成骨诱导液培养细胞，方法同1.2.1。于第7 天收集细胞，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，碱性磷酸酶孵育液孵育3～6 h，PBS 漂洗，待风干后观察染色情况。

1.2.8 茜素红染色

采用成骨诱导液培养21 d，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，每孔加入新鲜过滤的茜素红孵育液500μL染色。扫描仪及光学显微镜观察茜素红染色情况。

1.2.9 高通量表达谱芯片及下游靶基因实时定量PCR 初步验证

对MC3T3⁃E1Foxc2＋及MC3T3⁃E1EGFP细胞进行细胞基因芯片检测，主要步骤包括样品采集及总RNA提取、总RNA 的纯化和质量控制、cDNA 的合成、荧光标记cRNA 的合成纯化和浓度测定、cRNA 样品片段化和芯片杂交、芯片洗涤、芯片扫描、实验数据的处理分析。根据芯片数据分析结果选定潜在下游靶基因，并通过实时定量PCR 进行验证，操作同1.2.6。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 进行统计分析，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Foxc2 在MC3T3⁃E1 细胞成骨诱导后出现上调

在成骨诱导液、PTH、辛伐他汀的诱导后收集细胞样品进行检测，Foxc2 基因的表达水平在诱导初期即出现上调，而后缓慢回落至基线水平（图1）。

图1 实时定量PCR（A、C、E）和Western 印迹法（B、D、F）检测成骨刺激下的Foxc2 表达变化Fig.1 Real－time PCR analysis（A，C，E） and Western blot analysis（B，D，F） of Foxc2 expression after osteogenic stimulation

2.2 Foxc2 在MC3T3⁃E1 细胞株实现持续高表达

通过慢病毒转染，嘌呤霉素筛选培养MC3T3⁃E1Foxc2＋细胞株及MC3T3⁃E1EGFP细胞株，共聚焦显微镜检测到FITC 绿色荧光。继续培养，收集细胞样品进行后续实验。实时定量PCR 检测结果显示，MC3T3⁃E1Foxc2＋组Foxc2 mRNA 表达水平上调超过80 倍（P＜0.05）；Western blot 检测结果显示，MC3T3－E1Foxc2＋组出现过表达目的条带。上述结果提示，慢病毒成功转染MC3T3⁃E1 细胞并有效表达（图2）。

2.3 Foxc2 过表达抑制细胞增殖

如图3 所示，两组细胞增殖活性初期无明显差异；第4 天时，MC3T3⁃E1Foxc2＋细胞增殖活性降低，其在450 nm 处的OD 值小于MC3T3⁃E1EGFP细胞，而后差异逐渐增大，D4～D7 的差异具有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪分析显示两组细胞凋亡无明显差异。通过各周期细胞比例分析，MC3T3⁃E1Foxc2＋组的G1 期细胞比例增加，S 期和G2／M 期的细胞比例降低，其中G1 期细胞比例变化差异显著（P＜0.05）。

图3 慢病毒转染后两组MC3T3⁃E1 细胞增殖情况Fig.3 Proliferation of MC3T3⁃E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.4 Foxc2 过表达促进MC3T3⁃E1 细胞成骨向分化

成骨诱导液培养7 d，实验组的Runx2 的mRNA 和蛋白表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。诱导至第7 天时进行ALP 染 色，两组细胞均有着色，符合MC3 T3⁃E1 细胞的特性，对比发现过表达Foxc2 的实验组染色较深且着色细胞较多。第21 天时，茜素红染色实验，两组均成功观察到钙结节（图4）。

图4 慢病毒转染后两组MC3T3⁃E1 细胞成骨分化观察Fig.4 Osteogenesis of MC3T3⁃E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.5 siRNA 干扰Foxc2 表达，反向验证基因功能

提取siRNA 干扰MC3T3⁃E1 的细胞样品，实验组的Foxc2 的mRNA 及蛋白表达均减低，提示Foxc2－siRNA 成功转染。Foxc2 的表达水平降低后，可以观察到细胞的增殖能力较对照组有所提高，Runx2 的蛋白表达水平均有所下降，且ALP 染色变浅（图5）。

图5 Foxc2－siRNA 对MC3T3⁃E1 细胞的作用Fig.5 Effect of Foxc2－siRNA on MC3T3⁃E1 cells

2.6 基因芯片初步筛选下游靶基因并初步验证

MC3T3⁃E1Foxc2＋细胞与MC3T3⁃E1EGFP组差异表达的基因有1 234 条，其中上调基因950 条，下调基因284 条。将差异表达的基因带入KEGG 数据库进行通路分析，显示有25%的差异基因参与了细胞因子间的受体相互作用。选取MMP9、MMP13、EREG基因作为研究目标，并通过实时定量PCR 成功验证芯片结果（图6、7）。

图6 GO 分析和KEGG 通路分析Fig.6 GO analysis and KEGG pathway analysis

图7 实时定量PCR 验证芯片结果Fig.7 Real－time PCR verification of gene chip results

3 讨论

Foxc2 蛋白在人和小鼠两种种属间呈高度保守状态，参与了机体的众多生理过程。如果使用非特异基因敲除方法获得Foxc2 基因敲除小鼠，大多数的Foxc2－／－小鼠胚胎会在出生前死亡，少数可以出生，但存在明显发育缺陷，如主动脉弓离断、颅颌面骨缺损等，在口腔颌面部主要表现为正中腭裂、软腭缺失、上颌骨和蝶骨大翼发育不全及位置转移等［2，5］。淋巴水肿－重睫综合征（Lymphedema－distichiasis syndrome，LDS）是一种常染色体显性遗传病，人Foxc2 基因突变是导致LDS 的重要原因，LDS 常同时伴发椎骨畸形、硬膜外囊肿、上睑下垂、腭裂等症状，提示Foxc2 基因与人颅颌面发育密切相关［6－7］。Foxc2 同样影响人体脂代谢与骨改建，Yamada 等［8］于2006 年针对日本老年人群的研究指出，绝经后女性的桡骨远端以及整个机体的骨密度水平与Foxc2 的基因多态性明显相关。动物实验的结果同样验证了Foxc2 的功能：在小鼠肥胖－骨形成异常模型中可以发现Foxc2 表达水平在病变小鼠的白色脂肪组织内出现下调，同时病变小鼠的骨形成出现障碍［9］。上述研究均提示Foxc2 参与了颅颌面软硬组织发育过程及机体骨形成过程。

近些年关于Foxc2 功能的多项体外研究显示，在多种成骨诱导因子培养下，多种具有分化潜能的前体细胞内的Foxc2 表达水平显著升高［10－14］。本课题组前期研究表明，成骨诱导后的羊水干细胞中可检测到Foxc2 的高表达，初步证实了Foxc2 基因的过表达可抑制C3H10T1／2 细胞增殖；上调成骨相关基因Runx2 的表达，可促进细胞成骨向分化并抑制脂向分化［15］。但是，关于Foxc2 在成骨分化过程中的作用仍需继续研究。

Kim 等［16］指出，Foxc2 维持β－catenin 的活性，刺激TCF／LEF 转录活性，激活经典的Wnt－βcatenin 通路，同时cAMP－PKA 途径也参与其中。Gozo 等［17］提出，持续高表达的Foxc2 将促进前成肌细胞C2C12 成骨向分化的趋势，其主要机制在于Foxc2 直接作用于Wnt4 启动子区域，可激活Wnt4和BMP4 信号通路，从而抑制细胞成肌分化并转为骨向分化。Hsu 等［18］通过CRISPR 技术激活BMSC的内源性Wnt10b 及Foxc2 的共表达，可促进其骨向分化。Park 等［19］提出，Foxc2 的表达水平在骨代谢因子（甲状旁腺激素／BMP2）的刺激下出现上调，并且存在剂量表达相关效应。过表达Foxc2 可以刺激整合素β1 的表达，整合素β1 直接结合到Forkhead结构域的启动子上，从而调节细胞分化。

本研究中，首先采用多种成骨诱导因子作用于MC3T3⁃E1 细胞［20］，观测到Foxc2 的表达水平在细胞成骨分化过程中出现上调，而后逐步回落。成骨刺激作用较强的因子，如PTH，更易使Foxc2 在刺激的早期即出现上调。后续体外研究，通过设计慢病毒及siRNA 改变Foxc2 在MC3T3⁃E1 细胞中的表达水平，从而检测Foxc2 对细胞增殖活性、凋亡、周期以及分化能力的影响。稳转细胞系中，Foxc2 抑制MC3T3⁃E1 细胞的增殖活性，增加了G1 期细胞比例。G1 期细胞主要是增加质量且为后续的DNA 复制做好准备，Foxc 过表达使得细胞阻滞在G1 期，无法进行后续S 期及G2 期的DNA 复制加倍，导致细胞增殖活性降低。在分化能力的观察中，首先成骨关键转录因子Runx2 的表达水平在MC3T3⁃E1Foxc2＋组出现明显上调，第7 天进行碱性磷酸酶染色，MC3T3⁃E1Foxc2＋组ALP 染色较深，光学显微镜下着色细胞较多。第21 天，茜素红染色实验中，两组均成功观察到钙结节，此时两组无明显差异。siRNA 干扰实验结果同样验证了Foxc2 对MC3T3⁃E1 细胞体外骨向分化的影响。第一部分实验中，我们观测到Foxc2 的上调都出现在骨向诱导的早期，而后表达下调，逐渐回落甚至低于基线水平，提示Foxc2 在细胞成骨分化过程中仍受到其他负性因子的调控，故在培养第21 天，即成骨后期的茜素红染色钙结节实验中，两组细胞无明显差异。收集成骨诱导培养3天的MC3T3⁃E1Foxc2＋细胞及MC3T3⁃E1EGFP细胞样品，通过基因芯片进一步分析筛选下游靶基因，结果两组差异表达的基因共计1 234 条，其中上调950 条基因，下调基因284 条。将差异表达的基因导入数据库进行GO 分析和KEGG 通路分析，25%的差异基因参与了细胞因子间的受体相互作用，17%的差异基因参与了趋化因子信号通路，同样有17%的差异基因参与了细胞黏附分子通路（CAMs）。查阅文献，结合芯片结果，初步选取数个差异基因，如MMP家族、EREG 等。MMP 家族已经被证实在骨骼的发育中起着重要作用［21］，主要参与软骨细胞的增殖分化、成骨细胞及破骨细胞的募集、骨形成与改建等进程，MMP 功能的转变同样会影响骨质的形成。研究表明，EREG 可以与ERER 受体结合形成二聚体，通过激活AKT－ mTOR 通路及MAPK 通路促进MC3T3⁃E1 细胞骨向分化［22］。关于MMP9、MMP13及EREG 基因的实时定量PCR 结果也初步验证了基因芯片结果，为后续的研究提供了方向。

综上所述，本研究探讨了Foxc2 基因对MC3T3－E1 细胞体外骨向分化的影响，初步证明Foxc2 基因负向调控MC3T3⁃E1 细胞增殖活性，同时正向促进Runx2 表达并促进细胞体外骨向分化。本课题利用基因芯片进行筛选，查阅文献并结合数据分析，通过实时定量PCR 初步验证了数个差异基因，如Mmp9、Ereg 等，后续研究将在此基础上继续展开，明确其下游机制。