TGF-β1/Smad3信号通路在电针抑制兔耳增生性瘢痕中的作用机制

郑康华　　翁剑飞　　陈尚阳　　陈勇

[關键词] 电针;增生性瘢痕;TGF-β1;Smad3

[中图分类号] R363.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）15-0037-05

The mechanism of TGF-β1/Smad3 signaling pathway in the inhibition of hypertrophic scar of rabbit ears by electroacupuncture

ZHENG Kanghua1   WENG Jianfei1   CHEN Shangyang1   CHEN Yong2

1.The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou   350003， China; 2.College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou   350122， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of electroacupuncture in inhibiting hypertrophic scars in rabbit ears. Methods Sixteen of 64 New Zealand big-eared white rabbits were randomly selected as the blank group. The remaining rabbits were used to prepare hypertrophic scar rabbit ear models according to Li Huiyuan's literature. After the model was successfully established， they were randomly divided into the model group， electroacupuncture group and hand acupuncture group， with 16 in each group. The blank group and model group had no special treatment. The hand acupuncture group was given acupuncture stimulation. The electro-acupuncture group was given electric acupuncture stimulation based on the treatment of the hand acupuncture group. The changes in color， hardness， and thickness in each group are observed. Eight rabbits in each group were randomly selected and sacrificed on the 28th and 35th days after the operation. The scar tissue of rabbit ears was cut out. The HE staining， VG staining， scar hyperplasia index， and the changes of mRNA expression level detected by RT-PCR method in each group were observed. The changes after treatment in each group were compared. Results After one week and two weeks of acupuncture， compared with the model group， the number of fibroblasts and collagen fiber density in the scar of the electroacupuncture group decreased significantly in terms of HE staining and VG staining （P<0.05）. The arrangement of the dermis layer was relatively regular. In terms of scar hyperplasia index and mRNA protein expression of TGF-β1 and Smad3，the electroacupuncture group significantly decreased（P<0.05）. From the perspective of treatment time， the difference between the respective groups after one week and two weeks of acupuncture treatment was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture can significantly inhibit the proliferation of hypertrophic scars and reduce the mRNA protein expression of TGF-β1 and Smad3. Therefore， regulating the expression of TGF-β1/Smad3 signal pathway is its mechanism.

[Key words] Electroacupuncture; Hypertrophic scar; TGF-β1; Smad3

近年来，经济、社会的发展，使得人们对外在形象提出了更高的要求。在此环境下，医疗卫生领域对增生性瘢痕的研究也成为了热门的课题。瘢痕增生是真皮组织创伤形成伤口后组织修复异常的结果，其组织学特征在于成纤维细胞的增殖和细胞外基质的过度沉积。随着相关研究的不断深入，转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）在瘢痕生成中的作用目前已被发现。创伤产生后，TGF-β的过量分泌与表达，是诱发瘢痕增生的主要因素[1-2]。Smad3蛋白作为其下游信号，充当信号蛋白通路的作用，有助于促进瘢痕形成，被应用于介导转化生长因子β细胞反应[3]。已有研究发现，电针可以通过降低成纤维细胞增殖和胶原纤维蛋白含量而起到抑制增生性瘢痕的作用[4-5]。本研究运用电针治疗兔耳增生性瘢痕模型，通过观察兔耳的大体形学态、组织形态学和细胞因子TGF-β1、Smad3的影响，来研究电针对兔耳增生性瘢痕抑制效果，分析其抑制作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

64只成年健康雄性大耳白兔，体重2.0～3.0 kg，来自于上海松江区松莲实验动物场。许可证号：SCXK（沪）2017-0008。在福建省中医药研究院动物实验中心SPF级环境中进行饲养，用普通饲料喂养，环境温度23～26℃，自然通风。

1.2 模型制备

在适应性饲养64只大耳白兔7 d后，随机选择16只作为空白组，剩余的兔子参照李荟元文献制备增生性瘢痕兔耳模型[6-7]。手術前1 d，用电动剃毛刀将兔耳腹侧的毛剔除干净，并予术前8 h禁食。在动物手术室，完成常规消毒之后，用专用兔子固定器固定兔子，术前测量双侧兔耳皮肤厚度、硬度、比色卡值，并用事先制作好的内径1.0 cm×1.0 cm的正方形边框印章标记于兔耳腹侧面，每个兔耳标记4个1.0 cm×1.0 cm的正方形手术创面，各创面间距离>1.0 cm。然后用10%苯巴比妥钠溶液按100 mg/kg剂量腹腔注射，然后将2%利多卡因注射液用于标记线上的局部皮下麻醉，并沿标记线切开皮肤。分离骨膜，保留软骨，术后肌肉中注射青霉素（用量8万U/kg），使伤口自然愈合。手术21 d后，伤口愈合，痂皮脱落，动物造模成功后，随机分为模型组、电针组、手针组，每组各16只。

1.3 方法

1.3.1 空白组  无特别处置，正常饲养。

1.3.2 模型组  兔耳造模后无需处理，正常饲养。

1.3.3 手针组  兔耳造模后，于每日下午15时，用0.3 mm×13.0 mm的针灸针在正方形瘢痕组织对角线延长线0.5 cm处沿正方形的边线平行皮下透刺治疗，共4针，留针15 min，连续5 d，间隔2 d，再进入下一个疗程，连续2个疗程。

1.3.4  电针组  兔耳造模后，采用电针于每日下午15时对瘢痕进行干预，采用0.3 mm×13 mm的针灸针在正方形瘢痕组织对角线延长线0.5 cm 处沿正方形的边线平行皮下透刺治疗，共4针。针刺后，连接电针仪的电极，用频率为30/100 Hz，强度为3 mA，脉冲宽度为0.175 ms的连续波激励脉冲电流。持续时间为15 min，连续5 d，间隔2 d，然后进入下一个疗程，连续2个疗程。

1.4 标本采集

于手术后第28、35天每组各随机选取8只兔子处死，切开兔耳的瘢痕组织分为两份进行处理。一份用福尔马林溶液固定标本，石蜡包埋后切片，用于HE和VG染色观察。另一份储存在-80℃的液氮罐中，用于PCR检测。

1.5 观察指标

1.5.1 大体形态观察  术后21 d后，于第21、28、35天，记录瘢痕的厚度（用游标卡尺测量）、硬度（用LX-A邵氏A 型硬度计测量）、伤口颜色（采用比色卡比较观察）。

1.5.2 组织形态学观察  ①HE染色，在光学显微镜下（×200次）观察不同组瘢痕组织的成纤维细胞（NA）数量密度。②通过VG染色观察不同组瘢痕组织胶原纤维（AA）的面积密度。③瘢痕增生指数（HI）=从瘢痕隆起的最高点到耳软骨表面的垂直厚度/从瘢痕周围正常皮肤的皮肤边缘到软骨表面的垂直厚度。

1.5.3 对TGF-β1和Smad3信号转导通路的影响

1.5.3.1 提取总RNA  在液氮中于-80℃取出兔耳增生性瘢痕组织块，将其放入研钵中，添加液氮，然后用研磨机将其研磨成粉末（实验前将研钵和研磨机在180°C烘烤4 h以灭活RNA）。取出组织粉，将其放入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol试剂，充分混合并溶解。加入200 μL氯仿，充分摇匀并混合，放入高速冷冻离心机中，选择合适的转子，将温度设定为4°C，转速设置为12 000 rpm，离心10 min后，离心管分为三层。上清液主要为RNA，取400 μL添加入相同体积的氯仿，充分摇匀并混合，然后在4°C下以12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入等体积的异丙醇，并颠倒混合。在-20°C放置1 h后，在4°C以12 000 rpm离心15 min。可以在离心管底部看到白色沉淀，即RNA。弃去上清液，加入0.5 mL的75%乙醇，并在4°C下以10 000 rpm离心5 min。弃去上清液并短暂离心，用移液管吸干乙醇，并在真空下干燥2 min。加入20 μL DEPC水，在室温下溶解5 min，充分混合并短暂离心以获得RNA溶液。

1.5.3.2 基因定量  设置波长参数在260 nm与280 nm，用微量移液器移液器吸取1 mL DEPC水，置于RNA质量检测器的探针上校对，然后将1 μL的总RNA吸入仪器的探针中，并使用分析软件检测。当溶液的吸光度OD260/280比值为1.8～2.0时，根据光谱检测计算出RNA浓度和纯度。

1.5.3.3 去除基因组DNA反应   根据表1在冰上准备5 μL反应系统。为了确保反应溶液制备的准确性，请根据反应数+2制备预混液，并将其分配到每个反应管中，然后添加RNA样品。将以上试剂震荡混匀后置入PCR扩增仪中，并且在42℃下反应2 min后将温度降低至4℃。

1.5.3.4 反转录反应  按照表2于冰上进行配制10 μL的反应体系，同样为了保证反应液配制的准确性，按反应数+2的量配制Master Mix。轻柔混匀后立即进行反转录反应。将以上试剂混匀后置入PCR扩增仪中，设定温度37°C，反应15 min，再设定温度为85℃，反应5 s，然后降至4℃（如果不立即操作，可以将cDNA模板颠倒后放置在-20℃的冰箱中保存）。

1.5.3.5 Real Time PCR  ①按照表3于冰上进行10 μL PCR反应体系，按反应数+2的量配制Master Mix。引物序列见表4。②然后将将以上试剂混匀后放入PCR扩增仪中，进行RT-PCR反应。95℃预变性30 s，循环1次，再95℃变性5 s后，59℃退火、延伸30 s，循环40次。采用2-ΔCt 法进行数据分析：每个标本重复3次，取平均Ct 值，以GAPDH为内参照，ΔCt 值=靶基因GAPDH基因-Ct 值平均值;空白组为对照，ΔCt 值=待测靶基因ΔCt 值-空白组ΔCt 值。空白组的1，2-ΔΔCt 值为靶基因表达的倍数。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量数据资料以均数±标准差（x±s）表示。多组样本均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。要借助于LSD法来对方差齐时的组间实施比较，若方差不齐，就利用Games-Howell进行比较。检验的标准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔耳瘢痕组织大体形态学改变

术后21 d后，兔耳腹侧面伤口瘢痕基本形成，结痂脱落，能够明显地触摸到硬结，约为正常皮肤厚度的2倍，其增生范围限制在原伤口内。呈淡红色改变，随着时间的推移，瘢痕的色泽逐渐变淡，厚度变薄，硬度逐渐变软。针刺1周和针刺2周后，与术后21 d比较，模型组、电针组、手针组的术后28 d和术后35 d在颜色、厚度和硬度均有明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）;电针组的颜色、厚度和硬度均明显优于模型组（P<0.05）;与手针组比较，电针组的颜色、厚度和硬度比较，差异无统计学意义（P>0.05）;从治疗时间上看，各自本组的针刺1周与针刺2周之间两两相比，颜色、厚度和硬度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

2.2 针刺对兔耳增生性瘢痕组织学改变

HE 染色见模型组真皮组织明显增生变厚，增生瘢痕其组成大部分都是成纤维细胞、胶原纤维及新生血管等，其胶原排列没有规律，呈现出结节状和旋涡状;电针组和手针组瘢痕体积缩小，颜色呈淡红色、成纤维细胞数量缩减，排列相对规律。见封三图6。VG染色显示，模型组瘢痕组织中存在大量的粗大且排列不具规律的胶原纤维细胞以及胶原蛋白，不管是电针组还是手针组，其瘢痕体积都相对缩小，胶原纤维下降明显。见封三图7。

2.3 瘢痕增生指数HI

观察各组在针刺1周（术后的28 d）和针刺2周（术后的35 d）瘢痕增生指数，与模型组比较，电针组瘢痕增生指数均明显低于模型组（P<0.05）;与手针组比较，电针组瘢痕增生指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）;从治疗时间上看，各本组的针刺1周与针刺2周之间两两相比，瘢痕增生指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表6。

2.4 针刺对兔耳增生性瘢痕TGF-β1、Smad3的mRNA表达影响

使用RT-PCR检测兔耳瘢痕组织的TGF-β1、Smad3的mRNA表达情况，与针刺1周（术后28 d）和针刺2周（术后35 d）比较结果见表7。与模型组相比，电针组和手针组TGF-β1、 Smad3的mRNA表达量均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与手针组比较，电针组TGF-β1、Smad3的mRNA表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;从治疗时间上看，各自本组的针刺1周与针刺2周之间两两相比，TGF-β1、Smad3的mRNA表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

增生性瘢痕是创伤修复中必经的历程，所有达到真皮层深部的创伤伤口都以瘢痕愈合为主[8]。增生性瘢痕是由于皮肤纤维母细胞增殖和凋亡平衡失调所致的成纤维细胞过度增生的良性疾病[9]。TGF-β是一种具有多种生物学效应的细胞因子。其广泛存在于哺乳动物中。体内几乎所有细胞都合成并分泌TGF-β受体[10]。已经发现了三种亚型，特别是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。研究发现TGF-β的三个亚型，在生物反应中均广泛参与，但各亚型中，TGF-β所占比例最高，达到90%以上，且具有极强的活性。TGF-β参与创伤伤口愈合的整个过程，它既可促进成纤维细胞增殖，同时又分泌基质蛋白抑制其降解过程。TGF-β是当前研究中已知的最强的纤维化促进因子。通过抑制蛋白酶和基质酶的活性，同时促进细胞外基质（如胶原蛋白）的形成，从而促进细胞外基质的沉积，突显了TGF-β/Smads信号通路与瘢痕之间的关系[11]。TGF-β1在瘢痕形成过程中的作用，主要体现在抗瘢痕方面。当人体发生创伤后，机体TGF-β1的分泌量将随即增加，细胞活性同样可明显提升，机体原有的新陈代谢平衡被打破，成纤维细胞增殖和细胞基质沉积促进瘢痕增生。因此，增生性瘢痕是成纤维细胞过度增殖和胶原纤维过度沉积的结果。如果降低TGF-β1mRNA的表达，则可以达到抑制瘢痕形成的目的。Smad3蛋白是TGF-β1家族的下游信号蛋白。Smad3的主要功能是傳导信号并参与胶原蛋白的合成和收缩。因此，TGF-β/Smads信号转导通路起着重要的作用[12]，Smad3可以介导TGF的生物学作用，并在创伤后组织修复和重建过程中，参与了瘢痕增生，并在增生性瘢痕中Smad3 mRNA的表达量升高。因此，抑制Smad3信号通路可以阻止TGF-β1促进成纤维细胞的增殖，这不仅可以减少组织纤维化和病理性瘢痕的形成，而且可以延迟伤口的收缩[13-15]。

祖国医学认为，增生性瘢痕属于中医的“肉龟”“蟹足肿”“黄瓜痈”的范畴，关于瘢痕的病因病机认识，一般认为当肌肤遭受金属创伤、水火烫伤之后，邪毒与瘀血相结合，余毒未清，气滞血瘀，搏结经络皮部而成[16-17]。在临床运用针刺治疗增生性瘢痕大多收到良好的疗效，因此，针刺增生性瘢痕具有解毒散结、行气活血的功效。

实验研究结果表明，与模型组比较，电针组的兔耳瘢痕组织色泽、厚度、硬度均明显改善;HE和VG染色，真皮层厚度较薄，成纤维细胞数目和胶原纤维密度显著降低，排列相对规则;PCR实验结果显示，电针组TGF-β1、Smad3蛋白mRNA表达量明显减少（P<0.05）。但与手针组比较，电针组无论在瘢痕组织色泽、厚度、硬度方面、HE和VG染色还是PCR实验检测结果方面，电针组与手针组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。从治疗时间影响方面，针刺治疗1周和2周后，电针组和手针组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，经电针治疗后兔耳瘢痕组织中成纤维细胞、胶原纤维以及TGF-β1和其下游信号Smad3表达均有明显抑制作用，推测电针调节兔耳增生性瘢痕的机制可能与TGF-β1、Smad3的表达受到抑制有关，随着治疗时间的增加，电针的效应不断衰弱，推测可能是选用连续波，针刺产生了耐受。本研究结果显示电针在皮肤瘢痕动物模型中具有较好的治疗效果及抗瘢痕作用，可能是通过调控TGF-β1/Smad 3信号通路表达起作用，此将为临床应用电针治疗病理性瘢痕提供了一定的实验基础。针刺在治疗瘢痕上具有安全、有效、费用低的优势，今后将在临床中广泛推广。

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（收稿日期：2020-10-28）