新疆6个大果红枣裂果性差异及其内在原因分析

杨 磊，冯贝贝，靳 娟，樊丁宇，刘 晶，克里木·伊明，郝 庆

(新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站，乌鲁木齐 830091)

新疆气候独特，所产红枣果实品质极佳，深受市场欢迎，种植红枣经济效益较高。近年来，新疆红枣栽培面积迅速扩大，截止 2019 年，面积达 4.67×105hm2，产量3.728×106t[1]，已成为中国规模最大的优质干枣生产基地。然而，随着栽培面积的快速发展，裂果对新疆红枣产业造成的损失也逐渐凸显出来。据调查，南疆阿克苏市一般年份因裂果导致红枣减产30%，严重时可达50%[2]。而国内其他红枣主产区的裂果则更严重，例如，河北沧州金丝小枣产区因裂果造成的烂果率高达90%以上[3]。裂果已成为中国红枣产业发展中的主要问题之一[4]。

裂果是一种外界环境与果实内部生长不协调导致的生理疾病，多发于果实成熟期[5]。导致枣裂果的因素主要包括外因和内因两大部分[6]。其中，品种是影响裂果的重要因素，不同品种间裂果差异大[6-9]，这些差异由包括果皮组织结构[5-7]、细胞壁成分[10]和代谢相关酶活性[8-9]，以及果皮细胞壁松弛相关基因[11-15]，合成木质素、植物激素信号、植物病原体互作、淀粉和蔗糖代谢相关基因[16]，茉莉酸生物合成相关的α-亚麻酸代谢、表皮蜡质合成相关基因[17]等多方面因素造成。

本研究通过调查枣自然裂果率并结合浸泡诱裂试验，掌握不同大果形枣品种在新疆的裂果特点，并通过分析不同品种在果实组织结构、果皮中若干生理指标及扩展蛋白基因表达等方面的差异，探讨大果形枣品种的裂果与其形态、生理及扩展蛋白基因之间的联系，为枣的裂果深入研究提供理论依据，并为生产中抗裂品种引种栽培及品种选育等方面提供一定的参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 材 料

以新疆喀什地区叶城县“新疆农科院园艺所叶城果树试验站”红枣资源圃内7a生‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’、‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’、‘新郑大马牙’6个品种为对象，于2019年果实全红期，每个品种随机采集脆熟的正常枣果，分别装袋、标记，立即进行相关处理试验和指标的测定。

1.2 方 法

1.2.1 自然裂果调查于2019年9月29日，每个红枣品种选3株树，每株树随机选择树冠同一部位的一个侧枝，分别调查总果实数和裂果数，计算裂果率。

1.2.2 浸泡诱裂果调查为了对6个品种的自然裂果率进行对比验证，本研究也设置了清水浸泡诱裂果实的试验，分析它们的裂果率差异。以1.1中采集的正常枣果为对象，每个品种随机取30个果实，分3份装入尼龙网袋，浸泡于清水中，保持枣果全部浸没，分别于浸泡6、12、24、36、48和60 h时统计裂果个数，计算裂果率。以未浸泡的正常果实(0 h)为对照。

1.2.3 果皮细胞壁成分及代谢相关酶活性测定以1.1中采集的正常枣果为对象，用削皮刀削取果皮，尽可能不带果肉，果皮原果胶和可溶性果胶含量采用咔唑比色法测定；纤维素含量及果胶酶、纤维素酶活性采用试剂盒，通过双抗体夹心法测定，按照试剂盒说明书，提取枣果皮纤维素、果胶酶和纤维素酶液，并分别稀释相应的标准品后，按照说明快速完成操作。终止反应后15 min以内，以空白调零，在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中纤维素含量及果胶酶和纤维素酶活性。

1.2.4 解剖结构观察以1.1中采集的正常枣果为对象，每个品种随机取10个果实，用手术刀片切取枣果实中部位置0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，立即投入FAA(70%乙醇)固定。采用常规石蜡切片法制片，纵切，切片厚度10 μm，切片制好后放置于Motic BA400 TYPE 102M显微拍照系统进行观察、拍照。

1.2.5 扩展蛋白基因表达分析根据枣扩展蛋白ZjEXP基因家族中ZjEXP11和ZjEXP12在全红期果皮中高表达的研究结果[15]，本试验中也选择这两个基因进行验证。采用改良的LiCl沉淀法提取正常果实果皮RNA，使用TAKARA公司反转录酶(RR037)按10 uL体系进行反转录合成cDNA。使用Oligo 7.0软件进行设计引物，选用UBQ 作为内参，内参上游引物 UBQ-F，内参下游引物 UBQ-R (表 1)。以反转录生成的 cDNA 为模板，使用Roche 480 SYBR Green I进行实时荧光定量 PCR。每一个 PCR 反应均设置 3 次重复。反应体系为：SYBR Green Real-timePCR Master Mix(2×) 10 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，cDNA 模板 2 μL，加灭菌蒸馏水补至 20 μL。反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环。相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，应用SPSS(version17.0)软件进行方差分析。

表1 本研究所用引物

1.3 数据分析

应用 Microsoft Excel 2016 数据统计与分析， SPSS17.0 软件进行差异显著性测验，LSD法多重比较；ImageJ软件分析石蜡切片图像。

2 结果与分析

2.1 不同大果枣品种裂果情况比较

6个大果枣品种在果实成熟期的自然裂果率由高到低依次为 ‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’、‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’、‘新郑大马牙’(图1)。可根据自然裂果率将6个品种明显分成两组，即易裂组(‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’)和抗裂组(‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’、‘新郑大马牙’)。

HA.蛤蟆枣；JZ.晋赞大枣；XZ.新郑大马牙；JG.金谷大枣；ZX.赞新大枣；JU.骏枣;下同图1 不同大果枣品种果实成熟期自然裂果率HA. Hamazao； JZ. Jinzandazao； XZ. Xinzhengdamaya； JG. Jingudazao； ZX. Zanxindazao； JU. Junzao; the same as belowFig.1 Natural fruit cracking rate of different Ziziphus jujuba cultivars during fructescence

图2显示，随着清水浸泡时间的延长，不同大果枣品种的裂果率均持续上升，并以‘骏枣’、‘新郑大马牙’和‘赞新大枣’的裂果率增加趋势较为明显，‘金谷大枣’较为稳定，而‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’变化相对较平缓(图2)。其中，在浸泡24 h时，‘骏枣’、‘新郑大马牙’和‘赞新大枣’的裂果率已接近或超过80%，‘金谷大枣’达到51.11%，‘蛤蟆枣’为31.91%，‘晋赞大枣’仅为27.27%；在浸泡36 h时，‘骏枣’和‘新郑大马牙’的裂果率均超过95%，基本全裂；在浸泡60 h时，‘晋赞大枣’和‘蛤蟆枣’的裂果率分别为45.45%和59.75%，其余品种裂果率均基本在90%以上。通过浸泡诱裂试验发现，‘骏枣’、‘新郑大马牙’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’易裂果，而‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’表现出较强的抗裂果能力。

图2 不同品种枣果清水浸泡裂果率变化趋势Fig.2 The trend of fruit cracking rate induced by soaking in water of different Ziziphus jujuba varieties

对比同一品种的自然裂果率和浸泡裂果率发现，6个品种中除‘新郑大马牙’外，其他5个品种的浸泡裂果率和自然裂果率表现一致，即‘骏枣’、‘赞新大枣’和‘金谷大枣’为易裂果品种，‘蛤蟆枣’和‘晋赞大枣’为抗裂果品种。而‘新郑大马牙’的自然裂果率在6个品种中最低，仅有2.21%，属抗裂果品种；但在清水浸泡诱裂试验中属易裂果品种。

2.2 不同大果枣品种果皮及果肉细胞形态比较

6个大果枣品种的果实从组织结构方面均可分成 4 部分，由外向内依次是角质层、表皮层、亚表皮层和果肉薄壁细胞层(图3)。其中，角质层厚度以‘晋赞大枣’、‘新郑大马牙’和‘蛤蟆枣’较高，它们均显著高于 ‘赞新大枣’，而‘骏枣’和‘金谷大枣’居中，两者与其余品种均无显著性差异；各品种果实表皮层厚度仍以‘晋赞大枣’、‘蛤蟆枣’、‘新郑大马牙’较高，‘金谷大枣’居中，‘赞新大枣’和‘骏枣’较低，但在品种间无显著性差异。果实亚表皮层厚度以‘新郑大马牙’、‘金谷大枣’和‘蛤蟆枣’较高，它们显著高于‘赞新大枣’、‘晋赞大枣’和‘骏枣’，而前三者之间、后三者之间均无显著差异；同时，品种间果肉空腔(CA)占果肉面积比例存在明显不同，其中‘赞新大枣’最高(51.67%)，‘金谷大枣’和‘骏枣’居中，它们均显著高于‘晋赞大枣’、‘新郑大马牙’和‘蛤蟆枣’，而这3个品种间无显著差异(表2)。

A.蛤蟆枣；B.晋赞大枣；C.新郑大马牙；D.金谷大枣；E.赞新大枣；F.骏枣；CU.角质层；EC.表皮层细胞；SE.亚表皮层细胞；FC.果肉细胞；CA.空腔图3 不同大果枣品种果皮显微结构A. Hamazao； B. Jinzandazao； C. Xinzhengdamaya； D. Jingudazao； E. Zanxindazao； F. Junzao; CU. Cuticle; EC. Epidermal cell layer; SE. Second epidermal cell layer; FC. Fruit cell; CA. Cavity areaFig.3 The pericarp microstructures of different Ziziphus jujuba cultivars

表2 6个品种枣果实组织特征统计表

可见，在大果枣果实组织结构方面，抗裂果品种的角质层和表皮层明显较易裂果品种厚，并且果肉空腔占果肉面积比率明显较易裂果品种低。这表明裂果率与果实角质层和表皮层厚度，以及果肉空腔比率关系密切。

2.3 不同大果枣品种果皮细胞壁成分及代谢相关酶活性比较

各大果枣果皮纤维素含量从高到低均依次为‘骏枣’、‘新郑大马牙’、‘晋赞大枣’、‘蛤蟆枣’、‘金谷大枣’、‘赞新大枣’，前四者之间无显著差异但均显著高于‘金谷大枣’，而‘金谷大枣’又显著高于‘赞新大枣’。各品种果皮纤维素酶活性的表现与纤维素相似，以‘新郑大马牙’最高，它与‘骏枣’无显著差异，但显著高于其余品种；‘晋赞大枣’、‘蛤蟆枣’、‘金谷大枣’果皮纤维素酶活性之间无显著差异，但均显著高于‘赞新大枣’(图4)。以上结果说明本研究6个品种果皮中纤维素含量与纤维素酶活性呈正相关，但并未发现二者与裂果率存在明显的关联。可见，纤维素含量和纤维素酶活性对裂果是否有影响需要进一步研究。

不同小写字母表示品种间在0.05水平存在显著性差异，下同图4 不同大果枣品种果皮纤维素含量及其纤维素酶活性The different normal letters indicate significant difference among cultivars at 0.05 level; the same as belowFig.4 The cellulose content and cellulase activity in pericarp of different Ziziphus jujuba varieties

同时，各品种果皮原果胶含量由高到低依次为‘新郑大马牙’、‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’、‘晋赞大枣’、‘蛤蟆枣’，且品种间多存在显著性差异(图5)；可溶性果胶含量以‘骏枣’和‘晋赞大枣’显著较高， ‘赞新大枣’、‘蛤蟆枣’、‘金谷大枣’居中，‘新郑大马牙’最低，与其他品种均存在显著性差异；果胶酶活性‘蛤蟆枣’最高，其显著高于‘新郑大马牙’，两者均与其余品种差异显著， ‘骏枣’和‘赞新大枣’居中，‘晋赞大枣’和‘金谷大枣’较低，且与其余品种差异显著。可见，与易裂果大果枣品种相比，抗裂果品种果胶酶活性较高、原果胶含量更低。

图5 不同大果枣品种果皮果胶酶活性以及原果胶、可溶性果胶含量Fig.5 Activity of pectinase, contents of protopectin and soluble pectin in pericarp of different Ziziphus jujuba cultivars

2.4 不同大果枣品种果皮中两个ZjEXP 基因的表达差异

枣扩展蛋白ZjEXP基因家族中ZjEXP11和ZjEXP12在全红期果皮中高水平表达[12]。图6显示，6个大果枣品全红期种果实表皮中ZjEXP11的表达水平以‘赞新大枣’最高，‘金谷大枣’次之，‘骏枣’和‘蛤蟆枣’居中，而‘晋赞大枣’和‘新郑大马牙’明显较低；ZjEXP12的表达水平以‘金谷大枣’最高，‘赞新大枣’次之，‘骏枣’和‘蛤蟆枣’居中，‘晋赞大枣’和‘新郑大马牙’明显较低(图6)。可见，两个基因ZjEXP11和ZjEXP12的表达模式在6个大果枣品种中基本一致，抗裂果品种的表达水平更低，而易裂果品种相对较高。

图6 ZjEXP11 和 ZjEXP12 在不同大果枣品种果皮中的表达模式Fig.6 Expression pattern of ZjEXP11 and ZjEXP12 in pericarp of different Ziziphus jujuba cultivars

3 讨 论

裂果是一种生理病害，多发生于果实成熟期，不同品种间裂果性差异很大[6-9]。本研究根据6个大果枣品种自然裂果率和浸泡诱导裂果率的表现，‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’均为易裂果组，‘蛤蟆枣’、‘晋赞大枣’均属于抗裂果组，而‘新郑大马牙’在所有品种中自然裂果率最低，应属抗裂果品种，但在清水浸泡诱裂试验中属易裂果品种。其中的‘骏枣’为易裂果品种，与前人的研究结果一致[6, 18]。

本研究中6个品种枣果实组织解剖结构均可分成4部分，由外向内分别是角质层、表皮层、亚表皮层和果肉细胞层，与大果品种‘壶瓶枣’[10, 19]的结构相近。本研究中的抗裂品种‘晋赞大枣’、‘蛤蟆枣’和‘新郑大马牙’比易裂果品种‘骏枣’、‘赞新大枣’、‘金谷大枣’的表皮层和角质层明显厚、果肉空腔占果肉面积比例明显低。这与前人研究发现裂果率低的枣品种具有果实表皮层厚[7]、角质层厚[5-6]、果肉空腔少[20]的特点具有一致性。因此，上述特征在枣的引种栽培及抗裂品种选育具有一定的参考价值。

果实发育成熟过程中伴随着细胞壁组分的变化，而细胞壁参与维持细胞形态、增强细胞机械强度，并且还与细胞生理活动有关。细胞壁组分主要为纤维素、半纤维素和果胶等多糖物质。因此，细胞壁组分与裂果关系密切。外源喷施CaCl2处理能显著降低‘壶瓶枣’裂果率，并且裂果率与果皮和果肉中果胶酶活性、纤维素酶活性呈极显著正相关，与原果胶含量和纤维素含量呈极显著负相关[10]。而本研究发现易裂品种中的‘金谷大枣’和‘赞新大枣’纤维素和纤维素酶活性属于较低水平，可能与果实裂果存在着负相关关系，但是‘骏枣’的纤维素、原果胶、可溶性果胶含量及其胶纤维素酶活性都处于较高水平，可见导致枣果实的裂果原因是多因素造成的，需要进一步的探究、验证。

EXP家族基因普遍存在于果实中，是一种植物细胞壁蛋白，是细胞壁应力松弛的主要因素。它通过破坏细胞壁聚合物之间的氢键而在植物细胞生长中起重要作用[21]。已有研究发现，苹果[11]、番荔枝[13]、榴莲[14]等果实的EXP基因的表达水平与其裂果关系密切。有研究者为了分析番茄果实中水诱导开裂的响应网络，通过高通量测序建立了lncRNA-mRNA(激素-氧化还原细胞壁)网络，其中SlEXP的转录过程在该网络中发挥着重要作用[22]。在枣基因组中鉴定到了30个扩展蛋白基因，这些基因以不同的密度分布在枣树12条染色体中的10条中，可分为4个亚族：19个ZjEXPAs, 3个ZjEXPBs, 1个ZjEXLA, 和 7个ZjEXLBs，其中ZjEXPA11 和ZjEXPA12 在全红期果实中表达量较高[15]。在本研究中，6个品种中ZjEXPA11 表达水平以‘赞新大枣’最高，而ZjEXP12的表达水平以‘金谷大枣’ 最高，另外4个品种中ZjEXPA11 和ZjEXP12表达水平均表现为‘骏枣’>‘蛤蟆枣’>‘晋赞大枣’>‘新郑大马牙’，即这两个基因表达水平在抗裂红枣品种中较低。

番茄的裂果率与细胞壁和蜡质层的厚度以及细胞壁原胶和纤维素的含量显著相关。因为同时抑制番茄果实中聚半乳糖醛酸酶(SlPG) 和扩展蛋白 (SlEXP) 基因的表达可使 PG 和 EXP蛋白质含量降低，进而使得果皮中水溶性果胶含量减少，细胞壁增厚，果实硬度增加，果皮蜡质层变厚，从而降低裂果率[12]。这与本研究中得出的“抗裂果的枣品种有较厚的角质层和表皮层，较低的原果胶含量，以及更低的ZjEXP11和ZjEXP12表达水平”这一试验结果具有一定的相似性。

另外，本试验中自然成熟的‘新郑大马牙’果皮中ZjEXP11和ZjEXP12的表达量水平都处于最低的状态，并且符合角质层、表皮层厚且均一，表皮细胞排列整齐规则这一抗裂品种的果皮结构特点。但在浸泡诱裂试验中它的裂果率较高，被划归为易裂果品种。根据‘壶瓶枣’果实发育成熟过程中观察到表皮分布大量微裂隙[23]，并且在果实吸水开裂中起重要作用的结果[24]。本研究中‘新郑大马牙’果皮原果胶含量和果胶酶活性较其他品种更高，且在浸泡裂果的‘新郑大马牙’果实表面发现有微小裂纹，因此推测‘新郑大马牙’可能是因果皮原果胶含量较高、果胶含量较低，导致果皮形成微小裂隙，从而在浸水后果实发生开裂。但在本试验中没有做这方面的详细观察，这还有待进一步的验证。同时，裂果是一种数量性状，受多基因控制[25]，本研究只选了ZjEXP家族的2个基因进行分析，有较大的局限性。今后有必要借鉴其他果实裂果基因的研究结果在枣果上进行验证，筛选与枣裂果相关的基因。