糖基化大豆分离蛋白纳米乳液的制备及其稳定性研究

赵晨宇，布冠好，陈复生，于 珍

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

大豆蛋白来源丰富，价格低廉，具有较高的营养价值[1]和较好的功能性质[2-3]，是一种比较理想的植物蛋白类乳化剂，但在极端环境中蛋白质容易变性，难以维持体系的稳定性，因此通常与其他乳化剂结合[4]或采用改性等方式[5-6]，提高体系对抗环境变化的能力。糖基化是一种绿色、安全的改性技术，通过适当的干热或湿热处理，能够促使蛋白质的游离氨基与还原糖的羰基共价结合[7]，改变蛋白质的空间结构，有利于提高蛋白质的乳化特性[8]。通常分子量较小的单糖或二糖具有较高的反应活性，能够在短时间内生成更多的共价复合物[9-10]，同时也很容易生成美拉德反应副产物[11]；分子量较大的多糖具有较高的空间位阻效应，对蛋白质乳化特性的改善效果更好，但接枝效率较低，反应时间较长[12-14]。

低聚半乳糖是一类由半乳糖基和葡萄糖基构成的寡糖类混合物，在人母乳中含量较多[15]。因具有调节肠道菌群、改善肠道功能、调节免疫的能力[16-18]，一般用于生产婴幼儿配方乳粉。另外，低聚半乳糖分子量适中，具有较好的酸、热稳定性，并且能与蛋白质发生美拉德反应[19]，有效降低蛋白质的致敏性[20]。因此，作者旨在通过湿热糖基化制备大豆分离蛋白-低聚半乳糖共价复合物，再以复合物为乳化剂制备纳米乳液，研究酸、盐离子、温度对乳液稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白：河南省鲲华生物技术有限公司；低聚半乳糖：上海源叶生物科技有限公司；大豆油：益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；其余试剂：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DYY-6D型电泳仪：北京市六一仪器厂；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AH-BASIC 100高压均质机：德国ATS仪器公司；ZS90纳米粒度电位仪：英国Malvern Instruments Ltd。

1.3 方法

1.3.1 糖基化产物的制备

称取一定质量的大豆分离蛋白溶于0.05 mmol/L、pH 10.0的硼砂缓冲液中，配制成质量分数4%的溶液，搅拌过夜，按照质量比1∶ 1添加低聚半乳糖，磁力搅拌30 min后，80 ℃恒温水浴一定时间，立即采用冰水浴终止反应，4 ℃下透析48 h，冷冻干燥，得到不同反应程度的糖基化产物，储存于-20 ℃的冰箱备用。

1.3.2 纳米乳液的制备

称取质量分数0.5%的样品和0.02%的叠氮钠，添加去离子水，磁力搅拌2 h后，加入5% (V/V)的大豆油，以12 000 r/min剪切2 min，然后在50 MPa条件下均质1 min，得到纳米乳液[21]。

1.3.3 接枝度的测定

采用邻苯二甲醛法。参考Wang等[6]的方法略有改动，根据赖氨酸标准曲线，计算游离氨基含量。每个时间点下糖基化产物的接枝度按下式计算。

式中：C0和Ci分别表示反应时间为0 min和imin的游离氨基含量，mol/L。

1.3.4 褐变程度及中间产物的测定

参考Kim等[22]的方法略有改动。以10% SDS和0.05 mol/L硼砂的溶液为稀释液，褐变程度以420 nm处的吸光度表示，中间产物以294 nm处的吸光度表示。

1.3.5 溶解度的测定

采用考马斯亮蓝G250染色法。参考周洋莹等[23]的方法略做修改，配制5 mg/mL的蛋白溶液，4 500 r/min离心10 min，上清液为试样待测液。根据牛血清蛋白标准曲线，计算出样品中蛋白质含量。蛋白质溶解度按下式计算。

1.3.6 乳化特性的测定

参考Ma等[5]的方法略做修改。乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)按下式计算。

式中：N表示稀释倍数；θ表示油相体积比；L表示比色皿厚度，cm；C表示蛋白质质量浓度，mg/mL；A0、A10分别表示0 min和10 min的吸光度；10为2次测定的时间间隔，min。

1.3.7 SDS-PAGE测定

参考曹静等[12]的方法略做修改。配制蛋白质量浓度为2 mg/mL的样品溶液，选用4%的浓缩胶和8%的分离胶，采用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色。

1.3.8 乳液粒径、分散指数(PDI)及电位的测定

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定乳液的平均粒径、PDI及Zeta电位。仪器参数：折射率1.450，测试温度25 ℃，平衡时间120 s，每个样品测试3次[4]。

1.3.9 纳米乳液稳定性测定

酸处理：取适量乳液用0.1 mol/L HCl溶液调节pH至6.0。采用1.3.8中的方法测定乳液粒径变化，然后取5 mL于比色管中，室温(25 ℃±2 ℃)放置1周后记录乳液外观。

热处理：取适量乳液在80 ℃条件下处理30 min，冷却至室温，然后按上述方法测定乳液稳定性。

盐离子处理：取适量乳液与300 mmol/L NaCl溶液等体积混合，然后按上述方法测定乳液稳定性。

1.3.10 数据分析

采用SPSS 20.0和Origin 2019软件进行统计分析及作图，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 糖基化反应程度

反应时间对接枝度、褐变程度及中间产物的影响如图1所示。随着反应时间的延长，SPI与GOS的接枝度逐渐增加，最高达到43.23%；褐变程度及中间产物均呈现先增加后趋于稳定的趋势。原因可能是在反应初期，SPI的游离氨基基团不断暴露，并与GOS的羰基基团发生反应，引起接枝度、褐变程度及中间产物的增加；而在反应180 min后，接枝度持续增加，褐变程度趋于稳定，而中间产物有所减少，说明糖基化反应可能向着更高的阶段进行[24]。

注：不同字母表示同一组数据之间存在显著性差异，P<0.05。图1 反应时间对接枝度、褐变程度及中间产物的影响Fig.1 Effect of reaction time on grafting degree, browning degree and intermediate products

2.2 糖基化产物的功能特性

2.2.1 溶解度

蛋白质的溶解度决定了其在食品中的应用范围。由图2可知，糖基化反应可显著提高SPI在酸性条件下的溶解度。在pH 5条件下，溶解度的提高最为显著，且随着反应时间的增加而升高，反应240 min时溶解度为35.67%，相比同条件下SPI溶解度(0.26%)，提高了136倍。这与赵城彬等[9]采用葡萄糖和麦芽糖对大豆分离蛋白进行糖基化改性的研究结果一致。Saatchi等[25]认为这可能是因为糖基化反应导致蛋白质分子结合的亲水性羟基增加，减弱了蛋白质与蛋白质的相互作用，增强了蛋白质与水分子的亲和力，从而改善了蛋白质的溶解度。

注：SPI为大豆分离蛋白；SPI-GOS 90～240 min为不同反应时间的糖基化大豆分离蛋白。不同字母表示同一pH值下各样品之间存在显著性差异，P<0.05。图2 不同pH值下SPI及其糖基化产物的溶解度Fig.2 Solubility of SPI and glycated products at different pH values

2.2.2 乳化特性

由图3可知，糖基化产物的乳化活性随着反应时间的增加，呈现先上升后下降的趋势，乳化活性最高达到20.73 m2/g，较SPI(18.26 m2/g)提高了13.52%；乳化稳定性随反应时间的增加也有一定程度的提高，乳化稳定性最高达到17.84 min，较SPI(14.62 min)提高了22.02%，这与周洋莹等[23]的研究结果一致。一方面，糖基化反应提高了蛋白质在水相中的溶解度，可能加速了蛋白质在油水界面的吸附速率；另一方面，糖基化反应导致蛋白质构象的变化，这也是乳化性提高的原因之一[26]。

注：不同字母表示同一组数据之间存在显著性差异，P<0.05。图3 反应时间对糖基化产物乳化特性的影响Fig.3 Effect of reaction time on emulsification of glycated products

2.3 糖基化产物的分子量分布

由图4可知，SPI与GOS经糖基化反应后，各亚基条带颜色逐渐变浅，而在浓缩胶与分离胶交界处产生了新的条带，说明蛋白与糖发生反应生成了大分子聚合物；随着反应时间的延长，浓缩胶与分离胶交界处的条带逐渐变浅，说明随着糖基化反应的进行，可能生成了更多的大分子聚合物，且由于分子量较大难以进入分离胶[27]。

注：M为标准分子质量蛋白；1-7分别为SPI、SPI-GOS(反应时间分别为90、120、150、180、210、240 min)糖基化产物。图4 不同反应时间下糖基化产物的SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE of glycated products at different reaction time

2.4 纳米乳液的理化特性表征

2.4.1 平均粒径、PDI及Zeta电位

纳米乳液的平均粒径、PDI及Zeta电位如表1所示，与单独SPI稳定的纳米乳液相比，SPI-GOS共价复合物稳定的纳米乳液平均粒径及PDI均显著减小，Zeta电位绝对值显著增加。说明SPI-GOS共价复合物具有更好的乳化能力，可能是共价接枝的糖链提高了乳滴之间的静电斥力，从而使乳液更加稳定。

2.4.2 粒径分布

SPI及其糖基化反应产物稳定的纳米乳液粒径分布如图5所示。从图5可以看出，单独SPI稳定的纳米乳液粒径呈双峰分布，糖基化产物稳定的纳米乳液均呈单峰分布，且都偏向粒径较小的方向，这与表1相对应。

图5 SPI及其糖基化产物纳米乳液的粒径分布Fig.5 Particle size distribution of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

表1 SPI及糖基化产物纳米乳液的平均粒径、PDI及Zeta电位Table 1 Average particle size, PDI and Zeta potential of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

2.5 纳米乳液稳定性分析

2.5.1 酸稳定性

酸处理对SPI及其糖基化产物稳定的纳米乳液平均粒径、PDI及粒径分布的影响如图6所示。

由图6a可知，在酸性环境中，SPI稳定的纳米乳液的平均粒径和PDI与处理前相比(表1)明显增大，而糖基化产物稳定的纳米乳液均无明显变化。从图6b可以看出，经酸处理后，SPI稳定的乳液粒径分布明显向着粒径较大的方向移动，而糖基化产物稳定的乳液仍呈单峰分布。

图6 酸处理后纳米乳液的平均粒径、PDI及粒径分布Fig.6 Average particle size, PDI and particle size distribution of acid-treated nanoemulsion

2.5.2 盐离子稳定性

盐离子对SPI及其糖基化产物稳定的纳米乳液平均粒径、PDI及粒径分布的影响如图7所示。由图7a可知，加入盐离子后，SPI及糖基化产物稳定的纳米乳液的平均粒径、PDI相比处理前(表1)均有不同程度的增加，但随着反应时间的延长，糖基化产物稳定的纳米乳液变化幅度逐渐减小。从图7b可以看出，经盐离子处理后，所有乳液的粒径分布均呈现双峰特征，但糖基化产物稳定的乳液粒径分布更偏向于粒径较小的方向。

图7 盐离子处理后纳米乳液的平均粒径、PDI及粒径分布Fig.7 Average particle size, PDI and particle size distribution of salt ion-treated nanoemulsion

2.5.3 热稳定性

热处理对SPI及其糖基化产物稳定的纳米乳液平均粒径、PDI及粒径分布的影响如图8所示。如图8a所示，80 ℃处理30 min后，所有乳液的平均粒径及PDI相比处理前(表1)变化较小。从图8b可以看出，经热处理后，所有乳液的粒径均呈双峰分布，但糖基化产物稳定的乳液粒径分布更偏向于粒径较小的方向。

图8 热处理后纳米乳液的平均粒径、PDI及粒径分布Fig.8 Average particle size, PDI and particle size distribution of heat-treated nanoemulsion

2.5.4 乳液外观

酸、盐离子及热处理对SPI及其糖基化产物稳定的纳米乳液外观的影响如图9所示。从图9a、9b可以看出，SPI稳定的乳液在酸性和高离子浓度环境中放置1周后，出现了明显的絮凝现象，而糖基化产物稳定的乳液均未出现絮凝，说明糖基化反应能有效提高大豆蛋白基纳米乳液的酸稳定性和盐离子稳定性，这可能与糖链的空间位阻效应有关[28]。从图9c可以看出，经热处理后所有样品均未出现明显的分层现象，只有SPI的试管底部出现了轻微的乳析现象。

图9 酸、盐离子及热处理后纳米乳液的外观Fig.9 Appearance of nanoemulsion after acid, salt ions and heat treatment

3 结论

选用低聚半乳糖对大豆分离蛋白进行糖基化改性，以糖基化产物为乳化剂，制备纳米乳液，研究反应时间对大豆分离蛋白及其纳米乳液特性的影响。随着反应时间的延长，接枝度逐渐增加，反应240 min，接枝度达到43.23%；褐变程度及中间产物先增加，后趋于稳定；糖基化之后大豆分离蛋白的溶解度最高提高了136倍，乳化活性最高提高了13.52%，乳化稳定性最高提高了22.02%；SDS-PAGE表明糖基化反应生成了大分子聚合物；粒径及Zeta电位分析表明，糖基化产物稳定的纳米乳液粒径较小，具有更高的静电斥力，且反应时间越长，糖链的空间位阻效应越明显，乳液的酸、盐离子及热稳定性越好。因此，通过糖基化改性，提高了大豆蛋白基纳米乳液的加工环境稳定性，对于生物活性物质在纳米乳液体系中的包埋、传递具有重要意义。