高效液相色谱-蒸发光散射法测定酱腌菜中三氯蔗糖含量的不确定度评估

◎ 黄 宇，赵 嵩，张月松，汪 强

（马鞍山市食品药品检验中心，安徽 马鞍山 243000）

三氯蔗糖，又称为蔗糖素，在高温下甜度不变[1-2]，甜味纯正，其甜度约为蔗糖的600倍，是以蔗糖为原料的功能性甜味剂[3-4]，可有效减少肥胖人群和糖尿病患者对糖的摄入，被广泛用于各类食品中[5]。有研究表明，肠道菌群的失调与消化系统疾病、代谢性疾病有一定的联系[6]。肠道屏障和肠道内环境及其代谢物的相互作用形成肠道稳态，当三氯蔗糖进入肠道后，肠道微生物丰度降低和结构改变，促炎因子水平升高，肠道免疫屏障受损，无法有效抵制大量产生的肠道细菌毒素和病原体，致使肠道稳态失衡，导致机体持续的炎症和肠道组织损伤。同时，经过三氯蔗糖干预的肠道微生物组中耐药基因增加，耐药基因增加相应耐药细菌也将繁殖，最终可能导致更恶劣的肠道环境[7-8]，因此，三氯蔗糖在食品中的使用仍须严格控制。2019年12月，安徽省市场监督管理局发布了本年度第51期食品抽检信息，在466批次样品中检出6批次不合格样品，涉及甜味剂项目不合格样品3批次，其中三氯蔗糖不合格2批次，且不合格样品均为酱腌菜。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定腌渍的蔬菜中三氯蔗糖最大使用量为0.25 g·kg-1。当检测结果在限量值附近时，检测结果对酱腌菜是否合格有直接影响。不确定度评定是评价测量方法的合理性与科学性的有效手段之一，当不合格样品在复检时，不确定度也是评价测得值的准确度、可信度的定量指标。

本研究按照《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 22255—2014）中高效液相色谱-蒸发光散射检测法检测酱腌菜中三氯蔗糖含量，根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）和《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006—2019）建立数学模型，系统分析不确定度来源，通过对影响样品检测结果的不确定度进行评定，为当样品含量在限值附近的结果判定提供参考，对检验检测过程的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色谱仪（配G4260B蒸发光散射检测器，美国Agilent科技公司）；ME204E/02梅特勒-托利多电子天平（分度值：0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）；GL-21M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Arium-pro超纯水发生器（德国Sartorius公司）；A100250多管涡旋仪（月旭科技（上海）股份有限公司）；N-EVAP 5085氮吹仪（美国Organomation公司）；HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

三氯蔗糖标准品（纯度99.77%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯，美国TEDIA公司）；0.45 μm有机系滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

酱腌菜为市售五香萝卜条。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

（1）标准储备液：称取三氯蔗糖标准品0.1 g（精确至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成1 mg·mL-1的标准中间液。

（2）标准工作液：用5 mL吸量管分别吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL三氯蔗糖中间液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成浓度为20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的标准工作液。

1.2.2 样品前处理

称取1.5 g（精确至0.000 1 g）酱腌菜样品于50 mL离心管中，加入5 mL水涡旋振荡3 min后加入15 mL甲醇，继续涡旋20 min，以3 000 r·min-1离心10 min后，将上清液移入50 mL离心管中，沉淀物加入5 mL甲醇水溶液（75∶25，V∶V），涡旋振荡30 s，以3 000 r·min-1离心10 min，重复提取2次，合并上清液。上清液于沸水浴中氮吹至1 mL左右时，加入9 mL水，涡旋超声波处理10 min。向离心管中加入10 mL正己烷，振摇2 min后以3 000 r·min-1离心10 min，弃去正己烷层。取全部上清液移入已活化好的固相萃取柱中，控制液体流速不超过每秒1滴，用1 mL水淋洗，排干柱中液体，加入3 mL甲醇洗脱，洗脱液于氮吹仪中氮吹近干，加入1.0 mL乙腈水溶液（11∶89，V∶V）溶解，溶液过0.45 μm滤膜，待测。

1.2.3 仪器条件

色谱条件：C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；柱温：35 ℃；流动相：乙腈+水（11∶89，V∶V）；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1。

1.3 数学模型的建立

根据计算原理，可得酱腌菜的三氯蔗糖含量测定的数学模型[9]，定量结果按以下公式计算：

式（1）中：X为样品中三氯蔗糖的含量，g·kg-1；C为标准曲线查得样品进样液中三氯蔗糖的浓度，μg·mL-1；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g；R为回收率；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源的分析

高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定酱腌菜中的三氯蔗糖的不确定度主要来自标准溶液配制、标准工作曲线变动性、样品前处理、样品测量重复性、样品加标回收等环节。

2.2 不确定度的分量

2.2.1 标准溶液引入的相对标准不确定度urel(A)

标准溶液引入的相对标准不确定度urel(A)主要由标准品纯度相对标准不确定度urel(a1)，标准品称量引入相对标准不确定度urel(a2)和配制标准溶液的玻璃器皿引入的相对标准不确定度urel(a3)组成。

（1）标准品纯度相对标准不确定度urel(a1)。由三氯蔗糖标准物质证书所得纯度为99.77%，扩展不确定度为U=0.77%（k=2），标准品纯度不确定度按正态分布计算，则标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

（2）标准品称量引入相对标准不确定度urel(a2)。使用万分之一天平，按照纯度换算称取标准品0.100 2 g。根据该天平检定证书，在0～50 g称量范围内，最大允许误差为0.000 5 g，按照矩形分布计算得出标准不确定度为：

则相对标准不确定度为：

（3）配制标准溶液的玻璃器皿引入的相对标准不确定度urel(a3)。配制标准溶液的玻璃器皿引入的相对标准不确定度urel(a3)主要由玻璃器皿的容量允差产生的相对标准不确定度urel(V)和温度对体积的影响产生的相对标准不确定度urel(T)组成。从《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）获得容量器皿的允差δ，按照三角分布处理，取则标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

由于标准溶液配制需进行多次重复测定，而每次所用的容量瓶不可能保持完全相同，可认为容量瓶的体积误差和读数误差已随机化（有正有负），其不确定度分量可忽略，不再评定。温度对体积的影响主要包括温度对溶液体积和容量器皿的体积膨胀变化，容量器皿一般为硼硅酸盐玻璃，膨胀系数为1×10-5℃-1，忽略不计。温度对溶液体积的膨胀影响是指实验室使用标准溶液与温度配制时，温度间变动而产生的影响，该实验标准溶液现用现配，因此，不存在温度对体积的影响产生的相对标准不确定度。

（4）分度吸量管移液引入的相对标准不确定度urel(V1)。根据1.2.1方法配制标准溶液，移取标准溶液用的5 mL分度吸量管（A级），其体积允差为±0.025 mL，按三角分布处理，计算得出标准不确定度为：

5次移取标准溶液的相对标准不确定度可近似用其均方根计算：

（5）100 mL容量瓶定容引入的相对标准不确定度urel(V2)。使用的100 mL容量瓶（A级），其体积允差为±0.10 mL，计算得出标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

相对于2.2.1（4）中的相对标准不确定度可忽略。

（6）10 mL容量瓶定容引入的相对标准不确定度urel(V3)。使用的10 mL容量瓶（A级），其体积允差为±0.020 mL，计算得出标准不确定度为：

使用5个10 mL容量瓶引入的相对标准不确定度可近似用其均方根计算为：

相对于2.2.1（4）中的相对标准不确定度可忽略。

由以上数据可得三氯蔗糖标准溶液在配制过程中玻璃器皿产生的相对标准不确定度urel(a3)=2.51×10-2。

因此，三氯蔗糖在标准溶液配制过程中引入的相对标准不确定度为：

2.2.2 样品前处理引入的相对标准不确定度urel(B)

待测试样制备过程引入的相对标准不确定度主要来自样品称量引入的相对标准不确定度urel(b1)和待测试样定容引入的相对标准不确定度urel(b2)。

（1）样品称量引入的相对标准不确定度urel(b1)。准确称取1.5 g待测样品，根据所用天平检定证书，最大允许误差为0.0005 g，按照矩形分布计算得出：

（2）待测试样定容引入的相对标准不确定度urel(b2)。使用1 mL单标管吸取初始流动相定容，所用1 mL单标管容量允差为±0.007 mL，按照三角分布计算得出：

因此，样品前处理引入的相对标准不确定度为：

2.2.3 样品测量重复性引入的相对标准不确定度urel(C)

按照1.2的实验方法处理样品，得到6次独立测试的结果依次为 0.227 g·kg-1、0.214 g·kg-1、0.232 g·kg-1、0.208 g·kg-1、0.201 g·kg-1、0.215 g·kg-1，平均值为x-为0.216 g·kg-1。根据贝塞尔公式计算得出测量重复性引入的不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.2.4 标准工作曲线变动性引入的相对标准不确定度urel(D)

按照2.2的实验方法，对5个不同浓度的三氯蔗糖标准溶液进行3次测定，拟合出以I=a+bC形式的一元一次方程，根据公式（2）计算待测溶液的相对标准不确定度。标准工作溶液测定结果见表1。

表1 标准工作溶液测定结果表

式（2）中：SR为残差标准偏差；C0为待测样品溶液浓度平均值的对数值；b为斜率；a为截距；P为样品测定次数；n为工作曲线校准点测量次数；C-为标准曲线各点浓度对数的平均值。

由表1数据，根据蒸发光检测器原理得出酱腌菜中三氯蔗糖含量，利用最小二乘法拟合线性方程及统计结果，见表2。

根据表2中的数据，计算得出标准工作曲线变动性引入的相对标准不确定度：

表2 三氯蔗糖标准溶液线性方程及统计结果表

2.2.5 回收率测定引入的相对标准不确定度urel(R)

准确称取6份1.5 g空白样品，按照最大使用量0.25 g·kg-1向其中加入三氯蔗糖标准溶液，根据1.2的实验方法测定其加标回收率和相对标准偏差。其6次加标回收率分别为：92.2%、98.4-%、90.2%、90.0%、93.8%、96.6%，平均加标回收率R为93.53%，标准偏差S=3.42%，则回收率引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

采用t检验法对回收率进行显著性实验确定其在计算公式中是否使用。由《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）附录查知，在95%的置信区间内，自由度ν为5时，t0.95(5)=2.57。本实验n=6，自由度ν=5，计算得出：

当t≥2.57时，则回收率有非常显著性差异，因此该实验需要使用回收率校正结果为0.231 g·kg-1。

2.3 相对合成标准不确定度urel(x)

样品中三氯蔗糖测定结果相对合成不确定度为：

2.4 不确定度结果报告

假设测量过程中的误差属于正态分布，取置信区间P=95%，包含因子k=2，则酱腌菜中的三氯蔗糖含量测定相对扩展不确定度为：

Urel=k×urel(x)=2×3.71×10-2=7.42%

该实验测得样品中三氯蔗糖含量为扩展不确定度为：

U=742%×0.231=0.017 1 g·kg-1

高效液相色谱-蒸发光散射法测量酱腌菜中三氯蔗糖含量的结果表示为C=（0.231 0±0.0171）g·kg-1（k=2，P=95%）。

3 结论

本研究结果显示，标准溶液配制、样品重复测定和样品加标回收对三氯蔗糖含量测定的不确定度贡献最大。样品前处理和标准工作曲线拟合对最终结果影响较小，因此在实验中，样品处理和加标实验应保证各项操作的正确性和一致性。配制标曲时应选择较高精密度的器皿，注意其最佳使用量程，减少误差。当使用精密仪器，应选择合适的实验条件，注意各项操作规范，保证仪器设备的稳定性，降低不确定度，提高检测结果准确质量。