蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯致病菌的抑制作用

赵娜娜，潘潇涵，陈 清，常瑞雪，陈 硕，崔建宇，慕康国

（1. 中国农业大学资源与环境学院，北京 100193；2. 农田土壤污染防控与修复北京市重点实验室，北京 100193）

0 引 言

马铃薯是中国重要的农业经济作物之一，近年来随着马铃薯种植面积逐渐扩大，单一连作较为普遍，常年连作会导致土壤环境恶化，土传病害日益严重，严重制约了马铃薯产业的发展[1]。目前，防治马铃薯土传病害主要以轮作、选择耐性品种、合理施肥等农业防治以及喷洒农药等化学防治为主[2]，存在效率低、田间管理难度大和污染环境等问题。因此，开发一种经济有效、环境友好的防治方法受到广泛关注和研究。

有机废弃物中含有大量的营养成分和生物活性物质以及活体微生物，可以有效的防治土传病害[3-7]。有机废弃物防治植物病害的主要机制包括：利用活体微生物（生防放线菌、真菌、细菌）的拮抗、竞争、重寄生作用等机制抑制病原菌的生长繁殖、削弱其致病能力，或诱导宿主植物抗病性[8-9]；利用抑菌活性物质抑制土传病原菌生长，缓解土壤连作障碍，促进植物生长，提高植物抗病性[10]。因此，开发有机废弃物的生物活性功能符合可持续发展理念，不仅能抑制土传病害的发生，还可提高有机废弃物资源化利用程度，具有较高的经济效益和环境效益。

蚯蚓粪和活性污泥是2种极具代表性的有机废弃物，是当前生物防治研究的热点。蚯蚓粪是通过蚯蚓降解有机废弃物而产生的颗粒，有机物经蚯蚓消化后微生物群落发生改变，而且形成的蚯蚓粪具有较高的孔隙度和较大的表面积，含有丰富的活性微生物，包括链霉菌、木霉和芽孢杆菌等，因此蚯蚓粪广泛用于抑制土传病害，修复土壤连作障碍[11-15]。Simsek等研究发现蚯蚓粪能抑制黄瓜立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、卷心菜和西红柿根系烟草疫霉菌（Phytophthora nicothianae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）[16]。而且，将蚯蚓粪施入土壤中，可以提高土壤中微生物的数量和活性，增强病土自身对病原菌的抵抗能力。活性污泥主要由水和干物质组成，干物质分解会产生大量的营养物质和有机物，通过增加土壤中的有机质和养分含量来改善土壤团聚体的物理和化学性质，此外还可以促进植物生长和防治土传病害[17-18]。Ghini等通过大田长期定位试验系统研究了活性污泥对土传病原菌——番茄尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、大豆齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）、番茄核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、萝卜立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、黄 瓜 腐 霉 菌（Pythium aphanidermatum）和番茄青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum）的抑菌效果。结果显示，活性污泥施用有利于改善土壤的化学、物理和生物特性，同时表现出对植物土传病原菌不同程度的抑制作用[19]。

本文以2株马铃薯土传病原菌真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为靶标病原菌，探究了有机废弃物活性污泥和蚯蚓粪的浸提液对马铃薯土传病原菌的抑制作用。并通过盆栽试验分析对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的马铃薯茎溃疡病的防治效果，以及对马铃薯幼苗的促生作用。期望为马铃薯农业生产以及有机废弃物资源化利用提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试活性有机废弃物：蚯蚓粪，以秸秆和牛粪为原料进行堆制，青岛齐沃农业科技有限公司提供；活性污泥，是加工味精产生的污水经厌氧发酵后的沉淀物，由山东一家味精企业提供（表1）。

表1 有机废弃物浸提液的理化性状指标Table 1 Physical and chemical properties of organic waste extraction

供试病原菌：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）（R.solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）（F.oxysporum），均分离自马铃薯土传真菌病害，由中国农业大学植物保护学院提供。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基，即马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 活性有机废弃物浸提液制备

采用水浸提法制备浸提液[20]，分别称取10 g过0.2 mm筛的蚯蚓粪和活性污泥于250 mL 三角瓶中，加蒸馏水100 mL，置于25 ℃、200 r/min摇床，振荡培养90 min，然后用15μm孔径滤纸过滤，得到有机废弃物浸提液（固液比1∶10（kg∶L）），于4℃冰箱冷藏保存，备用。

1.3 废弃物浸提液皿内抑菌试验

用无菌水将蚯蚓粪浸提液、活性污泥浸提液及其1∶1复配液稀释至所需浓度，具体试验设置见表2。采用生长速率法测定抑菌效果，用无菌枪头吸取100μL稀释液，均匀涂布在PDA平板表面上，空白对照为加入等体积的无菌水。用打孔器将生长良好的立枯丝核菌、尖孢镰刀菌制成5 mm菌饼，接种在含有浸提液的平板中央，每个平板中放1个菌饼，放入28 ℃恒温培养箱，倒置培养3～10 d（视菌落生长情况而定），用十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长的抑制率，每个处理5次重复。

表2 活性有机废弃物浸提液稀释倍数Table 2 Dilution ratio setting of active organic waste extraction

1.4 蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯茎溃疡病的防效

1）供试作物及预处理

马铃薯，品种为费乌瑞它荷兰15号，用0.1%的NaClO溶液浸泡消毒20 min后用蒸馏水清洗，置于暗室催芽2～3周，挑选幼芽长短、大小一致的薯块切下用于盆栽试验。

2）供试土壤与病原接种体制备

供试土壤采自北京市房山，土壤基本理化性质见表 3。将土壤晒干、过筛，按照1∶1比例（V/V）将蛭石和土混合均匀，160 ℃下灭菌300 min后备用。

表3 供试土壤的基本理化性状Table 3 Basic physical and chemical properties of soil

病原菌接种体制备[21]：去皮小麦仁用蒸馏水冲洗2～3次并浸泡过夜，风干后置于锥形瓶内，每瓶150～200粒，121 ℃高温湿热灭菌40 min，冷却后备用；将立枯丝核菌接种于PDA平板上，28 ℃活化3～4 d，然后将灭菌的小麦仁均匀撒落在菌落上，继续培养5～8 d，作为接种体。

3）盆栽试验

将带芽薯块定植于14 cm×16 cm的塑料盆中，每盆装土1 kg（干土质量），在马铃薯幼芽正上方的土层上摆放1粒接种体，最后以无菌土覆盖。试验共设置11个处理（表4），每个处理5盆，每盆2株。定植当天浇灌各处理液100 mL，并在播种后15、30 d追施各处理液，浇灌于植株的根部，每盆每次浇灌100 mL。试验周期为40 d，第41 天收样。

表4 马铃薯苗期施加的浸提液及处理方式Table 4 The extraction and application method applied at the seedling stage of potato

1.5 指标测定

采用十字交叉法分别测量处理和对照的病原菌菌落直径。病原菌生长抑制率RI（%），计算公式

根据马铃薯黑痣病病情分级标准，统计盆栽马铃薯病情指数。计算公式如下

病害分级标准：0级，健康；1级，溃疡面积<10%；2级，溃疡面积10%～50%；3级，溃疡面积>50%；4级，植株死亡。

1.6 数据处理

采用 Microsoft Excel软件进行数据处理，采用Origin 2017软件作图，采用 SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓粪和活性污泥浸提液对病原菌生长的抑制作用

2.1.1 蚯蚓粪浸提液对病原菌生长的抑制作用

不同稀释倍数的蚯蚓粪浸提液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制作用见图1a。蚯蚓粪浸提液对病原菌的抑制作用随着稀释倍数的降低而增强，其中蚯蚓粪浸提液稀释100倍时，对立枯丝核菌的抑制率为78.3%，对尖孢镰刀菌的抑制率为60.1%。蚯蚓粪浸提液稀释1 000倍，对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别为62.8%和27.6%，对立枯丝核菌的抑制率与稀释20倍相比无显著差异，对尖孢镰刀菌抑制作用效果极大地降低。

图1 b表示灭菌后的蚯蚓粪浸提液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制作用效果。蚯蚓粪浸提液高温灭菌后对病原菌的抑制作用极大降低，病原菌菌落直径与空白对照相比差别不大。蚯蚓粪浸提液稀释100倍对立枯丝核菌的抑制率为18.4%，对尖孢镰刀菌的抑制率仅为5.3%。浸提液高温灭菌后对病原菌的抑制作用显著降低，可能是由于高温杀灭了蚯蚓粪中的微生物，使其丧失了对病原菌的抑制能力。胡艳霞等从蚯蚓粪中分离得到了两株链霉菌，其对多种病原真菌均有一定抑制作用[22]。穆静娟等从蚯蚓粪中筛选出一株具有广谱拮抗病原真菌的枯草芽孢杆菌M29，该菌株对10种病原菌均有抑制作用[23]。

2.1.2 活性污泥浸提液对病原菌生长的抑制作用

不同稀释倍数的活性污泥浸提液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制作用见图2a。活性污泥浸提液稀释10 000倍仍然显示出较高的抑菌活性，显著地抑制了病原菌的生长。随着浸提液稀释倍数降低，活性污泥浸提液对病原菌的抑制作用增强。活性污泥浸提液稀释100倍后对立枯丝核菌的抑制率为98.8%，对尖孢镰刀菌的抑制率为75.8%。活性污泥对立枯丝核菌的生长抑制作用极强，可能由于污泥中的成分对不同病原菌的作用程度不同，或与供试病原菌自身属性有关[24]。

由图2b灭菌后的活性污泥浸提液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制作用效果可知，活性污泥浸提液高温灭菌后对病原菌的抑制作用降低，菌落直径与空白对照相比差别不大。浸提液稀释100倍后对立枯丝核菌的抑制率为20.3%，对尖孢镰刀菌的抑制率为9.2%，表明污泥对病原菌的抑制作用主要是微生物的作用，Scheuerell等研究也表明，堆肥浸提液的生防效果与浸提液中的微生物数量有关[25]。

2.1.3 蚯蚓粪和活性污泥浸提液1∶1复配对病原菌生长的抑制作用

浸提液复配处理对立枯丝核菌和尖孢镰刀的生长的抑制作用见图3。与蚯蚓粪、活性污泥浸提液单独处理相比，同一稀释倍数浸提液复配处理后对病原菌的抑制作用提高。浸提液稀释1 000倍复配后，对立枯丝核菌的抑制率为98.6%，比蚯蚓粪浸提液单独处理提高约65.2%，比活性污泥浸提液单独处理提高18.8%；对尖孢镰刀菌的抑制率为72.6%，比蚯蚓粪浸提液单独处理提高216%，比活性污泥浸提液单独处理提高18.0%。

2.2 蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯茎溃疡病的盆栽效果

蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯幼苗茎溃疡病的防治效果见图4。蚯蚓粪和活性污泥浸提液均能够防治马铃薯苗期茎溃疡病，防治程度与浸提液稀释倍数相关，浸提液稀释倍数越小，对马铃薯茎溃疡病的防治效果越好。稀释倍数为50时，蚯蚓粪和活性污泥浸提液对病害的防治效果分别达75.0%和81.3%。有研究表明，废弃物中的微生物活性、营养元素以及其他的物理化学性质等几种因素共同发挥作用，抑制病原菌的繁殖，促进植株生长[26-28]。

蚯蚓粪与活性污泥浸提液混合处理对立枯丝核菌感染的马铃薯苗期病害的抑制效果与单一浸提液处理效果相比更好。混合液稀释倍数为200时，防效可达69.0%，与单独施用蚯蚓粪和活性污泥浸提液相比防效分别提高38.0%和21.1%。因此，活性污泥和蚯蚓粪混合施用对马铃薯幼苗生长的促进作用也起到了协同增效的效果。

图5 表示不同处理对马铃薯幼生长的影响。与病原菌对照相比，稀释50、200倍的蚯蚓粪浸提液对马铃薯幼苗的株高和茎粗具有显著的促进作用，株高分别较对照提高109.5%和42.9%，茎粗分别较对照提高95.6%和63.0%。活性污泥浸提液稀释50、200、400倍对马铃薯幼苗的株高和茎粗均具有显著促进作用，株高与病原菌对照相比分别提高81.6%、61.9%和47.6%，茎粗与对照相比分别提高81.4%、69%和60.8%。二者复配液稀释50、200倍对马铃薯幼苗的株高和茎粗具有显著的促进作用。其中，200倍稀释液施用后，与病原菌对照相比株高增长了56.8%，但两者复配对马铃薯幼苗的株高未表现出协同作用。

有机废弃物浸提液对马铃薯质量的影响如图5c和5d所示。稀释50倍、200倍的蚯蚓粪浸提液对马铃薯幼苗的干重具有显著的促进作用，质量分别较病原菌对照提高97.6%和77.6%。活性污泥浸提液稀释50、200、400倍对马铃薯幼苗的质量均具有显著促进作用，干重与对照相比分别提高78.0%、48.8%和36.6%。

3 结 论

本研究采用生长速率法测定蚯蚓粪、活性污泥浸提液及二者混和液的抑菌作用，并通过盆栽试验分析对马铃薯茎溃疡病防治作用和对马铃薯幼苗生长的促进作用，得出以下结论：

1）蚯蚓粪和活性污泥浸提液均能显著抑制病原菌生长，其抑制率随着稀释倍数降低而增强，且与蚯蚓粪和活性污泥浸提液单独处理相比，同一稀释倍数浸提液复配后对病原菌抑制作用有协同增效作用。

2）将有机废弃物浸提液高温灭菌后，对病原菌抑制效果极大的下降，与空白对照相比相差较小。蚯蚓粪浸提液稀释100倍对尖孢镰刀菌的抑制率仅为5.3%，活性污泥浸提液稀释100倍对尖孢镰刀菌的抑制率为9.2%。

3）施用蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯茎溃疡病有良好的防治效果，且两者混施起到了协同防治马铃薯茎溃疡病的效果，混合液稀释倍数为200时，与单独施用蚯蚓粪和活性污泥浸提液相比防效分别提高38.0%和21.1%。同时，有机废弃物浸提液灌根施用能促进马铃薯幼苗的生长。

综上，有机废弃物蚯蚓粪和活性污泥浸提液对马铃薯的2株致病菌具有抑制效果，且混合施用具有协同增效作用。因此，可将蚯蚓粪与活性污泥浸提液用于马铃薯土传病害的防治。