香槟薄荷和日本薄荷茎叶组织中挥发性组分的分析

柳璇璇，张浩宇，马月玲，刘霄芸，张昆明，谢玉芬，俞晓燕，张光弟,,*

（1.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021；2.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；3.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏银川 750021；4.宁夏设施园艺（宁夏大学）技术创新中心，宁夏银川 750021）

薄荷，属于唇形科薄荷属植物（Mentha haplocalyxBriq.），分布广泛，主要集中在北半球温带地区[1]，薄荷具有清热降火，可用于风热感冒、发汗解热、镇静镇痛、消炎抗菌等功效[2−4]。薄荷作为药食同源的物质，富含氨基酸、有机元素和维生素等多种营养成分，具有重要的营养和保健价值[5−7]，日本薄荷（Japanese Peppermint）经济效益高，主要用来提取精油，这是天然薄荷醇的主要来源。

本研究针对香槟和日本薄荷生长环境是基于鱼-花（薄荷）共生的一个闭环系统，鱼花（薄荷）共生系统是一种复合型生态体系，其主要表现为水中养鱼、水上种花（薄荷）的立体养殖模式，鱼的排泄物为薄荷提供营养，通过薄荷根系吸收水中硝态氮、吸附利用有机物，不仅具有一定的观赏价值，而且可以净化水质[8−10]。目前，对于薄荷在挥发性物质鉴别方面，大多数是利用顶空气相色谱法（GC-MS）进行挥发性成分的鉴别分析[11−13]，例如安秋荣等[14]利用GC-MS 法分析春、秋季薄荷油成分，发现春季薄荷油主要挥发性成分为薄荷酮、薄荷醇为主，秋季薄荷以薄荷酮及α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯为主。郭向阳等[15]利用GC-MS/GC-O分析，得出了薄荷叶片中的香叶醇、香茅醇及柠檬醛、香叶甲醛含量较多。气相离子迁移谱（GC-IMS）技术是集气相色谱和离子色谱的灵敏度高、分离程度好、操作简便等优点的新型分离技术[16−19]，也可进行低温鉴别，近年来广泛应用于食品加工、食品风味分析、品质检测等方面，例如陈通等[20]、李淑静等[21]利用GC-IMS 在植物油分类，鉴伪方面做了研究，表明该技术的简便快捷、无损高效特点；在饮料产品风味鉴别研究上，林若川等[22]应用GC-IMS 技术鉴别绿茶风味。此外，GC-IMS 技术在一些花卉，药食两用的植物挥发性成分研究中也有应用，例如马云等[23]对不同发育期忍冬花颜色与气味变化的监测就利用了该技术；林史珍等[24]用GC-IMS 监测高温、高湿加速破坏模拟条件下苦杏仁贮存过程中挥发性物质变化，发现随贮藏时间延长，苦杏仁挥发性物质中醇类、酮类物质总体含量呈升高趋势，酸类、酯类、烃类物质下降。

目前在薄荷的挥发性成分研究中，尚未见利用GC-IMS 技术对薄荷挥发性物质进行鉴别分析，本文以鱼-花（薄荷）共生的一个闭环系统中生长的香槟薄荷和日本薄荷为原料，利用气相色谱-离子迁移谱（GC- IMS）技术检测薄荷挥发性组分的变化，并结合聚类热图和主成分分析（principal component analysis，PCA）化学计量法对两个薄荷品种茎叶组织中挥发性成分加以区分，从而更有利于对未知薄荷样品进行种类鉴别，为不同薄荷品种在鱼花共生系统条件下净化水质能力与鱼花共生互作提供参考，同时为日本薄荷和香槟薄荷在精油提取、薄荷茶、薄荷香精香料、调味料等高质产品加工提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香槟薄荷和日本薄荷材料 来自于宁夏回族自治区银川市贺兰县光明渔村鱼-花（薄荷）共生的一个闭环系统，选取长势优良、无病虫害、生长状况一致的花前日本薄荷和香槟薄荷，取两种薄荷相同部位的茎和叶，分别装入EP 袋中，在−18 ℃条件下冷冻冷藏，备用。

FlavourSpec ®风味分析仪 德国海能仪器公司； SB224 型千分之一电子天平 北京佳源兴业科技有限公司。

1.2 样品前处理

将备用不同薄荷品种叶和茎分别取出后剪碎，分别称取叶和茎样品各1.0 g，置于20 mL 顶空进样瓶内，70 ℃孵育20 min 后进样；每个样品平行测定3 次。

1.3 分析条件

1.3.1 气相-离子迁移谱单元参数设置 FS-SE-54-CB-1 色谱柱（15 m× 0.53 mm，1 μm），分析时间45 min，色谱柱温度60 ℃；载气为高纯N2（≥99.999%）；IMS 温度 45 ℃。

1.3.2 自动顶空进样单元参数设置 采取自动顶空进样的方式，进样体积200 μL，孵育时间20 min，孵育温度70 ℃，进样针温度 85 ℃，孵育转速500 r/min。

1.3.3 气相色谱条件 离子源是正离子模式；载气为高纯氮气（99.999%），离子传输管温度45 ℃，色谱柱温度40 ℃，进样口温度85 ℃，离子传输管载气流速150 mL/min，色谱柱载气流速：0～2 min 时为2 mL/min；2～10 min 时，从2 mL/min 上升到10 mL/min；在10～20 min，流速急速上升到100 mL/min；在20～25 min 后，流速上升到150 mL/min，25 min 后，流速保持为150 mL/min 至45 min 后，分析结束。

1.4 数据处理

采用软件Laboratory Analytical Viewer（LAV）、定 性 软 件 GC×IMS Library Search（ 内 置 NIST 2014、IMS 数据库）对两种薄荷茎叶组织中挥发性物质进行定性分析，用LAV 中插件Reporter 和插件Gallery Plot 进行两种薄荷茎和叶样品间挥发性有机物的差异图谱分析，通过插件Dynamic PCA 和可视化TBtools 软件进行样品主成分分析，并采用Excel 2016 对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 两种薄荷茎叶组织挥发性物质的二维谱图分析

为反应离子峰（Reaction Ion Peak，RIP）。横坐标代表离子迁移时间（Drift Time，DT）；纵坐标代表气相色谱的保留时间（Retention Time，RT），RIP 峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，颜色越深表示浓度越大。白色表示薄荷挥发性物质浓度较低，红色表示薄荷挥发性物质浓度较高。

从图1 可看出，两种薄荷茎叶中挥发性组分之间存在较大的差异，香槟薄荷的叶茎挥发性化合物均少于日本薄荷的叶茎，两种薄荷叶片中的挥发性物质均多于茎中的挥发性物质，其中日本薄荷的叶片挥发性化合物明显多于香槟薄荷的叶片挥发性化合物，香槟薄荷茎中的挥发性物质也少于日本薄荷茎的挥发性物质，对于迁移时间和保留时间一致的挥发性化合物，两种薄荷茎叶组织部分的挥发性化合物峰面积存在较大差异。

图1 两种薄荷茎叶组织中挥发性有机物的GC-IMS 谱图（俯视图）Fig.1 GC-IMS spectra of volatile organic compounds in two kinds of mint stems and leaves (top view)

2.2 两种薄荷样品茎叶组织挥发性有机物定性分析

在GC-IMS 中，根据气相色谱的保留指数（RI）、保留时间（RT）、迁移时间（DT），通过软件GC×IMS Library Search 检索鉴定化合物，有些挥发性化合物检测出其单体和二聚体，两者属于同一种挥发性化合物，表1 中按单聚体化合物进行统计，在两种薄荷的茎叶中共定性出了41 种挥发性化合物，包括11 种醇、9 种酮、5 种醛、3 种呋喃、10 种酯类、1 种萜烯及含硫类化合物2 种，具体见表1。

表1 两种薄荷茎叶组织中挥发性化合物的定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in two kinds of mint stems and leaves

由表1 可以看出，醇、醛、酮、酯是薄荷中主要的挥发性成分，这也是薄荷在精油提取、薄荷茶饮料以及食品保健品等利用上含量较高的挥发性物质。两种薄荷茎叶中，共检测出了41 种挥发性物质，其中，醇类有11 种，在薄荷挥发油中，薄荷醇类含量较高，其次是酮类，这与刘莉等[25]的研究结果一致。在两种不同薄荷茎叶中，醇含量较高的有桉叶油醇、3-辛醇、反式-2-己烯醇和L-薄荷醇，在日本薄荷茎中，含量较高的是桉叶油醇和3-辛醇，其分别为28.1%和23.0%，在叶片中，含量较高的是反式-2-己烯醇（24.5%）和L-薄荷醇（16.7%），在香槟薄荷茎中，含量高的是桉叶油醇（19.8%）和反式-2-己烯醇（37.9%），在叶片中，含量较高的成分是桉叶油醇和3-辛醇，分别为35.0%和16.1%。两种薄荷相比，桉叶油醇在香槟薄荷中含量较高，其相对含量变化范围为19.8%～35.0%，反式-2-己烯醇在香槟薄荷中最多，其相对含量变化范围为14.3%～37.9%，醇类是薄荷精油提取中重要的挥发性物质，本研究旨在为薄荷提取精油方面提供更进一步的理论依据。

两种薄荷茎叶中，共检测出醛类化合物5 种，分别是异戊醛、苯甲醛、丁醛、正己醛，两种薄荷茎叶中，含量最高的是香槟叶片中的异戊醛，其相对含量变化范围为19.5%～49.4%，是茎中的1.8 倍，日本薄荷茎中，醛类物质含量较高的是异戊醛、正己醛，其含量分别为34.0%和32.7%，在叶片中含量最高的是苯甲醛，含量为45.5%，比茎中苯甲醛的含量高32.8%，醛类在油脂提取方面都有被检测出来，醛类是脂氧化的产物[26−27]，在其药用价值及其食用方面研究较少；

两种薄荷茎叶中，共检测出酮类化合物9 种，含量较高的是日本薄荷茎中的3-辛酮，叶片中的3-羟基-2-丁酮，香槟薄荷茎中的2-庚酮，叶片中的3-羟基-2-丁酮，4 种挥发性成分的含量分别为68.7%、28.1%、33.8%和49.7%。两种薄荷叶片中，均含有3-羟基-2-丁酮，但在日本薄荷的含量比香槟薄荷低21.6%，其中2,3-丁二酮是香槟薄荷中特有的挥发性化合物，其相对含量变化范围为5.7%～13.7%，3-辛酮和2-壬酮是日本薄荷中独有的挥发性化合物，3-辛酮在茎中的含量高达68.7%，2-壬酮含量相对比较低，其相对含量变化范围为0.5%～5.7%，酮类物质也是薄荷在精油提取中的主要挥发性物质。

两种薄荷茎叶中，共检测出酯类物质有10 种，在香槟薄荷茎叶中，酯类化合物只有2-甲基丁酸甲酯和乙酸乙酯2 种，其中2-甲基丁酸甲酯含量是酯类中最高的，其相对含量变化范围为82.7%～88.6%，乙酸乙酯相对含量变化范围11.4%～17.3%，在日本薄荷中，10 种酯类化合物都有，含量最高的是叶片中的乙酸乙酯，其含量为62.1%，比在茎中的含量高16.3%。

除了以上四类化合物是薄荷主要的挥发性物质之外，其它类化合物检出了呋喃类3 种，萜烯1 种，以及含硫化合物2 种，其中α-蒎烯在日本薄荷茎中含量为48.5%，2-正戊基呋喃是在日本薄荷中有的化合物，在香槟中没有，这也可以作为区别两种薄荷的依据，2-乙酰基呋喃在香槟薄荷茎叶中含量都很高，其含量分别为94.1%～61.4%，二甲基硫在日本薄荷茎中，香槟薄荷茎叶中含量都比较高，分别是75.5%、85.9%和80.5%，甲硫醚在日本薄荷叶片的含量高达93.4%，薄荷中，甲硫醚具有抗氧化、降血压和降血糖的作用，α-蒎烯具有抗炎、抗病毒、体外抗肿瘤等生物活性[28]。

2.3 日本薄荷和香槟薄荷茎叶组织指纹图谱特征分析

为了更加明确日本薄荷和香槟薄荷茎叶中的差异物质以及进行量化，因此利用二维的指纹图谱，鉴别不同薄荷品种茎叶的特征峰区域[29−30]，GC-IMS 指纹图谱分为两部分，如图2、图3 所示。图中X 轴为检测到的薄荷挥发性化合物，右侧Y 轴代表薄荷品种的编号（每一行为一个薄荷品种茎叶组织的指纹图，每个薄荷样品做3 个平行），图中亮点的颜色及深浅表示不同薄荷茎叶含量的高低。

由图2、图3 可看出，同一薄荷品种中检测到茎和叶的挥发性成分有很大差别，各自的特征峰区域不同，也有共同的特征峰区域，由图2、图3 中可以看出，大量挥发性成分在日本薄荷叶片中的含量更高。日本薄荷叶片中，特征性挥发物质含量较高的是3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-甲基呋喃、3-辛酮、异丁酸乙酯、芳樟醇、丁醛、桉叶油醇、2-甲基丁酸甲酯、甲硫醚、薄荷醇、3-甲基丁醛、2-乙基呋喃、己醛、异丁醇、α-蒎烯、1-戊醇、2-丁酮、3-戊酮和反式-2-己烯-1-醇等；在日本薄荷茎中，含有的特征性挥发物质主要有：乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、2-壬酮、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、1-己醇和己酸乙酯等。在香槟薄荷叶片中，含量较高的挥发性物质包括：2-乙基呋喃、丙酮、己醛、2-甲基呋喃、2-丁酮、2-己酮、3-甲硫基丙醛、芳樟醇、反式-2-己烯-1-醇、苯甲醛、3-戊酮、3-辛醇、2-甲基丁酸甲酯、α-蒎烯、2-庚酮和桉叶油醇等；在茎中含量较高的有：1-己醇、2,3-丁二酮、异丁醇、1-戊醇和二甲基三硫等，两种荷相比较，在日本薄荷茎中的含量远高于香槟薄荷茎，比如2-壬酮、乙酸异丁薄酯、乙酸异戊酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丁酯和己酸乙酯等；日本薄荷叶中的丙酮、薄荷醇等的含量高，分别为19.9%和16.7%，香槟薄荷叶中的2-甲基丁酸甲酯的含量达到88.6%，是日本薄荷茎中含量的5.9 倍；2-庚酮在日本薄荷叶中的含量和在香槟薄荷茎中的含量都比较高，分别达到了17.3%和33.8%；在醛类中，丁醛在香槟薄荷茎和叶中的含量比较高，分别为16.0%和28.5%；苯甲醛在日本薄荷叶中的含量比在香槟薄荷含量高32.7%；桉叶油醇、3-辛醇和1-辛烯-3-醇在日本薄荷茎中的含量远低于叶片，通过比较相互茎和叶的挥发性有机物的含量，可以看出日本薄荷中的挥发性化合物总体多于香槟薄荷，其中2,3-丁二酮是香槟薄荷中独有的挥发性化合物，其茎中含量为5.7%，叶中含量为13.7%，而2-壬酮、3-辛酮、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯和乙酸丙酯是日本薄荷独有的酯类挥发性有机物，在香槟薄荷中尚未检出。

图2 两种薄荷茎叶组织中挥发性有机物的GalleryPlot 图（左侧图）Fig.2 Gallery Plot of volatile organic compounds in menthol stem and leaf tissues ( on the left)

图3 两种薄荷茎叶组织中挥发性有机物的GalleryPlot 图（右侧图）Fig.3 Gallery Plot of volatile organic compounds in menthol stem and leaf tissues ( on the right)

2.4 两种薄荷茎叶组织热图

通过挥发性有机物峰体积对两种薄荷挥发性物质进行可视化热图聚类分析（图4）和主成分分析（图5），可以更直观的看出日本薄荷和香槟薄荷茎叶组织中挥发性化合物的差异，从图4 的聚类分析可得，两种薄荷茎叶可聚为3 类，1-L 日本薄荷叶和2-L 香槟薄荷叶聚为一类，1-S 日本薄荷茎，2-S 香槟薄荷茎各为一类。结合表1 和图4 可以看出，两种薄荷叶片中挥发性成分整体高于茎，日本薄荷茎中乙酸乙酯含量最高，叶片中3-辛酮含量高，香槟薄荷茎中桉叶油醇含量高，叶片中反式-2-己烯醇含量最高，对图5 的PCA 分析可以看出，两种薄荷茎叶中，第一主成分PC-1 贡献率为49%，第二主成分PC-2 贡献率为28%，二者累计贡献率为77%，两种薄荷茎和叶距离很远，表明它们之间存在较大差异，日本薄荷中叶片的含量比茎中含量高，这是因为叶片吸收植物光合作用及根部营养比茎中多。香槟薄荷茎和叶距离很远，表明它们之间存在较大差异。日本薄荷和香槟薄荷中，叶片和茎之间的挥发性成分差异很大，这与前人研究的结果相似[31−35]，可以各自聚为一类，主成分分析和系统聚类分析所得结果基本一致。结果表明GC-IMS 分析结果能较好地判别和区分不同薄荷品种不同部位组织中的差异。

图5 两种薄荷茎叶组织中挥发性有机物PCA 分析Fig.5 Analysis of volatile organic compounds in the tissues PCA two menthol stems and leaves

3 结论

在两种薄荷茎叶组织中共检测出了41 种挥发性成分，主要包括11 种醇、9 种酮、5 种醛、3 种呋喃、10 种酯、1 种烯烃及2 种含硫类化合物。其中茎叶中，醇和酮是主要的挥发性化合物，这两类化合物也是薄荷精油提取中主要的挥发性物质，除此之外，还有些像α-蒎烯等这样的萜烯类挥发性化合物，具有一定的抗炎、抗病毒、抑菌等作用，在薄荷茎叶中含量都比较高；两种薄荷叶片都含有部分特征性挥发有机物，例如香槟薄荷中独特的2,3-丁二酮，日本薄荷中的2-乙基呋喃，借助于这些成分的特异性，可为鉴别薄荷品种和薄荷不同产地的方法提供一定的理论基础，其特征性挥发性成分，也可作为某些特定食品中的天然食品添加剂，日本薄荷茎中的特征性挥发性物质最多，例如茎中的乙酸龙脑酯、2-壬酮、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丁酯和己酸乙酯等，日本薄荷叶片和茎相比较，叶片中所含的挥发性有机物种类更多、含量更高，而茎中也有少量挥发性有机物含量远高于叶片，香槟薄荷中的茎挥发性成分的含量也低于叶片；通过可视化热图和PCA 分析可知，两种薄荷叶片中的挥发性有机物成分和含量差异很大。如果通过更多的样品进行建模，这一结果也将为薄荷叶片和薄荷茎在有机物区分上以及对未知薄荷样品进行种类鉴别提供一定的理论依据。通过以上结果，利用薄荷不同组织特征性挥发性化合物，可为将来在食品香精香料、调味品等薄荷深加工方面，提供科学、合理的建议和支撑。