响应面-主成分分析法优化大曲发酵桑叶茶工艺

何建新，胡艳玲，何汶珊，雷诗涵，刘诗泳，罗仕洋，屈廷啟

（湖北工业大学工程技术学院，湖北武汉 430068）

桑叶为国家卫生部药食同源[1]名录的品种。桑叶中含有黄酮、生物碱、挥发油、甾类、糖类、氨基酸、蛋白质等[2−3]活性成分，具有降血压、降血脂[4]、降血糖[5−6]、抗炎[7]、抗病毒[8]、抗衰老[9−10]、减肥[11]和抗癌[12]等多种疗效。目前随着我国经济的发展和人民生活水平的提高及价值观念和生活方式的改变，人们对以桑叶为原料研制的食品和保健品有了进一步的认识，对这类产品的需求逐步增大，尤其是桑叶茶倍受消费者青睐[13−14]。

目前桑叶茶加工以桑绿茶为主[15]，普遍存在汤色发黑、豆腥味重、感官品质不佳[16]等问题，有的研究涉及了现代微生物发酵工艺[17]，如陈永丽等[18]采用米曲霉和毛霉研究桑叶茶的水浸出物含量、感官评分和游离氨基酸含量变化，肖洪等[19]采用黑曲霉、日本根霉和绿色木霉研究桑叶中脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）、黄酮、多糖和多酚生物活性成分含量的变化，但都未见有效去除桑叶茶青腥味的方法，实验制得的桑叶茶饮用口感欠佳。目前国内外将大曲用于桑叶茶发酵的方法尚未见报道。传统大曲含有丰富的营养，如碳水化合物、蛋白质以及适量的无机盐等，能够供给有益微生物生长所需要的营养成分[20]。且其菌种量大，含量相比小曲、红曲多，多菌种发酵提供了多种微生物混合体系，对发酵产品质量、风味起着至关重要的作用[21]。通过发酵，桑叶中有效的生物活性成分黄酮、多酚含量会有一定程度的增加，蛋白质会水解成氨基酸，产生风味物质[19,22,23]，提升饮用品质及营养价值。

本文采用新鲜桑叶为原料，首次利用浓香型大曲发酵桑叶茶，通过单因素实验、响应面-主成分分析法确定最佳发酵工艺条件，改善桑叶茶口感，提升桑叶茶品质，保留桑叶茶中黄酮、氨基酸等有效成分，以期为桑叶产业化发展提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑叶 湖北宜昌地区，秋季果桑；宜宾产浓香型大曲 武汉天龙黄鹤楼酒有限公司；水塔陈醋 市售；芦丁（99%）、没食子酸（99%）、茚三酮（99%）、福林酚显色剂（BR） 上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠、盐酸、磷酸盐缓冲液、谷氨酸 分析纯，国药集团。

UPT-II-20T 超纯水制备设备 成都超纯科技有限公司；DK-S22 型恒温水浴箱、DUG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；CP213 型电子天平 国象斯仪器上海有限公司；STARTER3100 型pH 计 OHAUS；1000u 型移液枪 迈德飞；752N 型紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；800Y 型高速多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；SHB-III 型抽滤机 上海比朗仪器有限公司；JP-020 型超声波清洗机 深圳市洁盟清洗设备有限公司；DH3600B-II 型生化培养箱 天津泰斯特。

1.2 实验方法

1.2.1 桑叶茶发酵工艺流程 桑叶→分级（根据叶片大小）→洗涤→盐渍→洗涤→醋蒸→洗涤→揉捻→发酵→中温烘干→高温烘培

采摘：统一采摘湖北宜昌地区新鲜桑叶，清洗干净；

盐渍：盐水浓度为2 g/L[21]，倒入浸渍池中，取清洗后同一级别的桑叶放入盐水中，并轻轻翻动，使桑叶和盐水充分接触，在盐水温度为30 ℃时下盐渍22 min；

醋蒸：将水塔陈醋用水调制成60 mL/L 食用醋水倒入蒸锅底部，加盖，加热至醋水沸腾，揭盖，取盐渍后的桑叶经洗涤后置于隔篦上，铺匀，加盖继续加热，15 min 后揭盖，转入下道工序；

揉捻：待桑叶微风萎凋，沥干水分后，将桑叶切割成长宽各2～3 cm 的叶片，置于揉捻机中揉捻成球状体，转入下道工序；

发酵：参考雷诗涵等[21]的方法，并稍作修改，称量上道工序预处理过的桑叶，置于带盖的发酵缸中至满缸。按照每组实验的初始糖度、大曲接种量、叶子含水量称取所需桑叶重量的特制大曲、蔗糖，置于灭菌的三角瓶中，用适量水溶解并搅拌，待液面有气泡出现，均匀淋撒于发酵缸中桑叶表面，轻轻按压，盖上缸盖，置于对应温度下发酵24 h，而后调至55 ℃，发酵24 h，结束发酵。

干燥：将发酵后桑叶均匀铺撒在烘箱的隔篦上，80 ℃烘干。烘焙期间，每隔20～25 min 将桑叶翻动一遍，待桑叶表面干燥，揉搓可碎裂时，即烘干完成；调整烘箱温度在120 ℃，持续通风加热，待烘箱通风口散发出清香，烘焙基本完成，然后将桑叶置于相对湿度55%～65%的洁净环境中使其回潮、冷却，待桑叶温度降至室温时，即制得桑叶茶。

1.2.2 单因素实验 固定初始条件为：发酵温度35 ℃，初始糖度8%，大曲接种量8%，叶子含水量70%，在其他条件固定的情况下，考察发酵温度（15、20、25、30、35 ℃）、初始糖度为（4%、6%、8%、10%、12%）、大曲接种量（4%、6%、8%、10%、12%）、叶子含水量（60%、65%、70%、75%、80%）对桑叶茶中总酚、氨基酸、黄酮含量以及感官评价的影响。

1.2.3 响应面试验 据单因素实验结果，以桑叶茶发酵的发酵温度（A）、初始糖度（B）、大曲接种量（C）、叶子含水量（D）为自变量，规范化综合得分为响应值，根据Box－Behnken 中心组合原理设计四因素三水平的试验，确定最佳工艺，实验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.4 氨基酸测定 按照GB/T 8314-2013 茶游离氨基酸总量的检测方法[24]进行测定。

1.2.5 黄酮测定 精密称取桑叶粉5 g，置锥形瓶中，加入85%乙醇100 mL，超声辅助萃取两次，于35 kHz 下每次30 min，过滤，并用少量的乙醇洗涤滤渣，定容到250 mL，摇匀，即得到总黄酮的样品液。吸取1.0 mL 样品液稀释5 倍，按照亚硝酸钠-硝酸铝法[25]测定，加入0.5 mol/L 的NaNO2溶液0.5 mL 摇匀，5 min 后加入0.3 mol/L 的Al（NO3）3溶液0.5 mL，摇匀，加入1.0 mol/L 的NaOH 溶液2.5 mL，用80%乙醇定容至8 mL，在波长510 nm 处测OD 值。以吸光度（A）为纵坐标，卢丁标准溶液的浓度（C）为横坐标，得到线性方程为A=1.3291C−0.0153，R2达到0.9995，通过标准曲线方程换算，计算出样品中的黄酮含量。

1.2.6 总酚测定 精密称取桑叶粉1 g，加沸水80 mL，沸水浴浸提30 min，趁热过滤，定容至100 mL，即得到总酚样品液。吸取1 mL 样品液，按照福林酚法[25]测定，将样品液置于25 mL 的棕色容量瓶中，加蒸馏水至6.0 mL，然后加入福林酚显色剂0.5 mL，混匀，在0.5～8 min 内加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30 ℃避光放置0.5 h，760 nm下测定吸光值。以吸光度（A）为纵坐标，没食子酸标准溶液的浓度（C）为横坐标，得到线性方程为A=3.7327C+0.0149，R2达到0.9992，通过标准曲线方程换算，计算出样品中的总酚含量。

1.2.7 感官评价 按照国标GB/T 23776-2018 茶叶感官审评方法[26]进行评价。

1.3 数据处理

对桑叶发酵茶的各指标进行了主成分分析，得到原始数据的贡献率、累计贡献率及特征值，将大于1 的特征值因子作为主成分提取标准。按式（1）计算桑叶发酵茶各个样品的综合得分F，再按公式（2）将得到的综合得分F 进行规范化处理得到规范化综合得分Z。

式中:F 为综合得分，Y1、Y2、Y3为主成分的特征值，F1、F2、F3为桑叶发酵茶的主成分1、2、3 的得分，C 为累积特征值，Z 为规范化综合得分，Fmax为综合得分中最大值，Fmin为综合得分中最小值。响应面试验设计以及结果分析用Design－Expert 8.0.6 软件进行处理，主成分进行因子分析采用SPSS 25.0 软件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵温度对桑叶发酵的影响 由图1 可知，当发酵时间一定时，随着温度的升高，茶叶中氨基酸含量升高。发酵温度极大地影响着菌种的代谢产物以及发酵速率，温度升高，菌种代谢速率变快，微生物利用桑叶中的蛋白质生成氨基酸的速率变快[18]。温度变化对总酚含量无明显影响。黄酮含量呈现先升后降的趋势，在30 ℃时，黄酮含量最高，这与孙国霞等[27]的研究结果相近。桑叶茶感官评价先升后降，25 ℃时口感最佳。因此，综合温度对桑叶茶中总酚、氨基酸、黄酮以及感官评价的影响，选择30 ℃为最佳发酵温度。

图1 发酵温度对发酵桑叶茶品质的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.2 初始糖度对桑叶发酵的影响 由图2 可知，初始糖度决定发酵度，随着初始糖度的增加，总酚，黄酮在桑叶中的含量逐渐降低。氨基酸含量在初始糖度为4%～8%时变化不明显，在8%～10%时逐渐降低，感官评价先升后降。初始糖度过高，渗透压过大，抑制微生物的生长，使发酵不彻底[28]，初始糖度过低，菌种繁殖缺乏碳源及能源，导致发酵不足，最终影响代谢产物种类、含量和桑叶茶的风味。因此确定初始糖度最佳为6%，在此条件下桑叶茶的氨基酸、黄酮、总酚含量相对较高，感官品质较好。

图2 初始糖度对发酵桑叶茶品质的影响Fig.2 Effect of initial sugar content on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.3 大曲接种量对桑叶发酵的影响 由图3 可知，随大曲接种量的增大对总酚含量无明显影响，黄酮的含量逐渐下降，这与肖洪等[29]的研究结果相近。氨基酸含量和感官评价先升后降。随大曲接种量增大，发酵速率变快，代谢加强，菌种之间竞争激烈，发酵体系变化，菌种代谢速率的快慢改变，影响代谢产物种类、含量和桑叶茶的风味[30]。因此确定最佳接种量为8%，在此接种量下桑叶茶澄清，茶香纯正浓郁，桑叶茶感官品质良好，茶中黄酮和氨基酸含量也相对较高。

图3 大曲接种量对发酵桑叶茶品质的影响Fig.3 Effect of Daqu inoculation amount on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.1.4 叶子含水量对桑叶发酵的影响 由图4 可知，随着叶子含水量的增加，桑叶中黄酮含量相对下降，氨基酸在叶子含水量60%～70%时变化并不明显，在70%～80%时呈现下降趋势，总酚含量和感官评价先升后降。可能由于含水量过高，发酵物粘度过大，导致氧气供应受阻，菌体的生长以及酶的合成受到影响[18]，含水量过低导致发酵物过干，微生物难以生长，影响产物的合成[31]，最终影响代谢产物的种类、含量和桑叶茶的风味。含水量为65%时，总酚、氨基酸、黄酮含量以及感官品质相对较高，故确定最佳叶子含水量为65%。

图4 叶子含水量对发酵桑叶茶品质的影响Fig.4 Effect of leaf moisture content on the quality of fermented mulberry leaf tea

2.2 响应面试验结果

根据表1 进行Box－ Benhnken 中心组合实验设计，共29 个试验点，研究各因素对桑叶发酵茶氨基酸，总酚、黄酮、感官评价的影响。响应面试验设计及结果见表2。

2.2.1 桑叶发酵茶的主成分分析 桑叶发酵茶的主成分分析采用SPSS 25.0 对表2 中桑叶发酵茶指标氨基酸，总酚、黄酮、感官评价进行主成分分析，主成分的特征值、贡献率和累积贡献率见表3，根据大于80%的累积贡献率原则[30]，提取的三个主成分累积贡献率为87.692%，可以说明提取的三个主成分能够全面地反映桑叶发酵茶的品质信息。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 桑叶发酵茶主成分的贡献率及特征值Table 3 Contribution rate and characteristic value of principal components of mulberry leaf fermented tea

由表4 知，根据指标的特征向量绝对值大小可以看出，决定第一主成分的指标主要是感官评价、氨基酸，第二主成分的指标主要是总酚、黄酮，第三主成分的指标主要是总酚、黄酮。

表4 桑叶发酵茶的指标特征向量值Table 4 Index characteristic vectorial values of fermented mulberry leaf tea

由于各个指标间存在单位和变异程度的差异，因此对综合得分F 进行规范化处理后得到规范化综合得分Z，再以Z 作为响应值进行响应面分析，其结果如表5 所示。

表5 主成分得分及规范化综合得分Table 5 Principal component score and standardized comprehensive score

2.2.2 规范化综合得分的响应面分析 利用Design－Expert 8.0.6 软件对29 个实验点和对应的规范化综合得分进行多元归拟合，得到回归模型方差分析见表6，各因素间的相互作用见图5，得到的回归模型方程如下:

图5 各因素间的交互作用Fig.5 Interaction between factors

Z=0.97−0.086A+0.023B+0.036C+0.25D+0.011 AB−0.052AC+0.062AD−0.00415BC−0.018BD−0.12 CD−0.16A2−0.094B2−0.17C2−0.44D2。由表6 回归模型方差分析可知，P<0.0001，该模型项显著性极高，并且该模型失拟项P>0.05，差异性不显著，表示建模成功，决定系数R2=0.9550，用此模型可以很好地描述和分析实验结果。各因素中，一次项A、D 差异极显著（P＜0.01），B、C 不显著，交互项CD 差异显著（P<0.05），AC、BD、AB、AD、BC 不显著（P>0.05），二次项A2、C2、D2差异极显著（P<0.01），B2差异显著（P<0.05）。按照比较F值大小可知影响桑叶茶发酵品质的因素顺序为：叶子含水量（D）>发酵温度（A）>大曲接种量（C）>初始糖度（B）。

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

2.2.3 各因素交互分析 由图2 可以看出，叶子含水量与大曲接种量的响应面坡度最陡峭，其等高线形成半椭圆，表明CD 的交互作用显著（P<0.05），表明对响应值规范化综合得分影响较大。

2.2.4 验证实验 根据响应面分析软件得出的最佳工艺条件参数为:发酵温度28.85 ℃，初始糖度6.16%，大曲接种量8.1%，叶子含水量66.3%，在此条件下，规范化综合得分为1.0105±0.01。通过对预测工艺优化确定条件进行调整发酵温度为30 ℃，初始糖度为6%，大曲接种量为8%，叶子含水量为65%发酵桑叶茶，最终得到桑叶发酵茶黄酮含量为35.81 mg/g，氨基酸含量为1.38 mg/g，总酚含量为16.68 mg/g，规范化综合得分为0.996±0.02，与预测的数值基本一致，因此该模型基本准确，表明响应面分析与主成分分析法相结合得到的桑叶茶发酵工艺参数具有一定的可靠性，有实用价值。

3 结论

以桑叶为原料，浓香型大曲为菌种发酵桑叶，经优化实验确定最佳发酵工艺条件:发酵温度30 ℃，初始糖度6%，大曲接种量8%，叶子含水量65%，制得桑叶茶黄酮含量为35.81 mg/g，氨基酸含量为1.38 mg/g，总酚含量为16.68 mg/g。通过实验发现，大曲发酵桑叶茶是可行的，可以有效增加桑叶茶的风味物质，改善桑叶茶的口感，通过优化工艺参数，可以有效保留桑叶中的活性成分，对桑叶茶的开发利用具有一定的指导意义。